Việc thẩm vấn giao diện giữa các tiểu đơn vị của kênh proton Hv1 mở bằng đầu dò được ghép đôi

Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo tiếp tục được hỗ trợ, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu dáng và JavaScript. Kênh proton kiểm soát điện áp Hv1 là một phức hợp dimeric bao gồm hai miền cảm nhận điện áp (VSD), mỗi miền chứa một đường dẫn thẩm thấu proton có kiểm soát. Quá trình giảm thiểu được điều khiển bởi miền cuộn dây tế bào chất. Quá trình chuyển đổi từ trạng thái đóng sang trạng thái đóng trạng thái mở trong cả hai VSD được biết là xảy ra hợp tác; tuy nhiên, người ta biết rất ít về các cơ chế cơ bản. Giao diện giữa các tiểu đơn vị đóng một vai trò quan trọng trong các quy trình phân lập; tuy nhiên, các giao diện như vậy chưa được xác định trong các kênh Hv1 mở. Ở đây chúng tôi chứng minh rằng các dẫn xuất 2-guanidinothiazole chặn hai Hv1 VSD theo cách hợp tác và sử dụng một trong các hợp chất này làm đầu dò cho sự liên kết dị lập thể giữa các tiểu đơn vị mở. Chúng tôi thấy rằng ngoại bào phần cuối của đoạn xuyên màng đầu tiên của VSD tạo thành một giao diện giữa các tiểu đơn vị làm trung gian cho sự ghép nối giữa các vị trí liên kết, trong khi miền cuộn dây không tham gia trực tiếp vào quá trình này. Chúng tôi cũng tìm thấy bằng chứng mạnh mẽ cho thấy bộ lọc chọn lọc proton của kênh kiểm soát khả năng hợp tác liên kết với chất chặn . Các kênh proton kiểm soát điện áp đóng vai trò quan trọng trong nhiều loại sinh vật, từ thực vật phù du đến con người1. Trong hầu hết các tế bào, các kênh này làm trung gian cho dòng proton thoát ra từ màng proton và điều chỉnh hoạt động của NADPH oxyase. Kênh proton kiểm soát điện áp duy nhất được biết đến ở người là Hv1, là sản phẩm của gen HVCN12,3.Hv1 (còn gọi là VSOP) đã được chứng minh là có vai trò trong sự tăng sinh tế bào B4, sản xuất các loại oxy phản ứng bởi hệ thống miễn dịch bẩm sinh5,6,7,8, tế bào tinh trùng sự vận động9 và điều chỉnh độ pH của chất lỏng bề mặt đường thở10. Kênh này có liên quan đến một số loại ung thư biểu hiện quá mức như khối u ác tính tế bào B4,11 và ung thư vú và ung thư đại trực tràng12,13. Hoạt động Hv1 quá mức được phát hiện là làm tăng khả năng di căn của tế bào ung thư 11, 12. Trong não, Hv1 được biểu hiện bởi microglia, và hoạt động của nó đã được chứng minh là làm trầm trọng thêm tổn thương não trong các mô hình đột quỵ do thiếu máu cục bộ. Protein Hv1 chứa miền cảm nhận điện áp (VSD), bao gồm bốn đoạn xuyên màng được gọi là S1 đến S414. VSD giống với các miền tương ứng của các kênh Na+, K+ và Ca2+ phụ thuộc vào điện áp và các phosphatase nhạy cảm với điện áp, chẳng hạn như CiVSP từ Ciona gutis15. Trong các protein khác này, đầu C của S4 được gắn vào mô-đun tác động, miền lỗ chân lông hoặc enzyme. Trong Hv1, S4 được liên kết với miền cuộn dây (CCD) nằm ở phía tế bào chất của màng .Kênh này là một phức hợp dimeric bao gồm hai VSD, mỗi VSD chứa một con đường thẩm thấu proton có kiểm soát16,17,18. Hai tiểu đơn vị Hv1 này đã được tìm thấy để mở hợp tác19,20,21,22, cho thấy rằng sự liên kết allosteric và tương tác giữa các tiểu đơn vị có vai trò một vai trò quan trọng trong quá trình giao phối. Giao diện giữa các tiểu đơn vị trong miền cuộn dây được xác định rõ vì cấu trúc tinh thể của hai miền biệt lập có sẵn22,23. Mặt khác, giao diện giữa các VSD trong màng không được hiểu rõ. Cấu trúc tinh thể của protein tinh tinh Hv1-CiVSP không cung cấp thông tin về giao diện này, vì tổ chức tam phân của phức hợp kênh kết tinh có thể là kết quả của việc thay thế CCD Hv1 nguyên gốc bằng dây kéo leucine men GCN424. Một nghiên cứu gần đây về tổ chức tiểu đơn vị của kênh Hv1 đã kết luận rằng hai chuỗi xoắn S4 chuyển sang CCD mà không làm gián đoạn nghiêm trọng cấu trúc thứ cấp, dẫn đến các chuỗi xoắn dài bắt đầu từ màng và chiếu vào tế bào chất. Dựa trên phân tích liên kết ngang cysteine, nghiên cứu này đề xuất rằng các VSD Hv1 liên hệ với nhau dọc theo đoạn S4. Tuy nhiên, các nghiên cứu khác đã đề xuất các giao diện thay thế giữa các VSD. Các giao diện này bao gồm các đoạn S1 17, 21, 26 và các đầu ngoài của đoạn S2 21. Một lý do có thể dẫn đến xung đột kết quả của những nghiên cứu này là sự ghép đôi giữa các VSD đã được kiểm tra liên quan đến quá trình giao phối, phụ thuộc vào trạng thái đóng và mở, và giao diện giữa các VSD có thể khác nhau khi thay đổi trạng thái khác nhau về hình dạng. Ở đây, chúng tôi thấy rằng 2-guanidinothiazole ức chế kênh Hv1 bằng cách liên kết hiệp đồng với hai VSD mở và sử dụng một trong các hợp chất, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), để thăm dò sự tương tác giữa các tiểu đơn vị ở trạng thái mở. giao diện. Chúng tôi thấy rằng đường cong liên kết GBTA có thể được mô tả tốt bằng mô hình định lượng trong đó liên kết của chất ức chế với một tiểu đơn vị dẫn đến sự gia tăng ái lực liên kết của tiểu đơn vị liền kề. Chúng tôi cũng nhận thấy rằng dư lượng D112, bộ lọc chọn lọc cho kênh 27, 28 và một phần của vị trí liên kết dẫn xuất guanidine 29 kiểm soát khả năng hợp tác liên kết GBTA. Chúng tôi cho thấy rằng liên kết hợp tác được duy trì trong dimer Hv1, trong đó CCD tách khỏi phân đoạn S4, cho thấy rằng giao diện giữa các tiểu đơn vị trong CCD không trực tiếp làm trung gian cho sự liên kết allosteric giữa các vị trí gắn GBTA. Ngược lại, chúng tôi thấy rằng đoạn S1 là một phần của giao diện giữa các tiểu đơn vị và đề xuất sắp xếp các VSD liền kề với đầu ngoại bào của chuỗi xoắn S4 cách xa tâm của dimer để cho phép đoạn S1 ở trạng thái mở. Các chất ức chế phân tử nhỏ của Hv1 rất hữu ích như thuốc chống ung thư và chất bảo vệ thần kinh. Tuy nhiên, cho đến nay, rất ít hợp chất có thể ức chế kênh30,31,32,33. Trong số đó, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, hợp chất [1] trong Hình . 1a) và các dẫn xuất của nó đã được phát hiện là có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của proton qua kênh VSD29,32. Sự liên kết của các hợp chất như vậy được cho là xảy ra độc lập trong hai tiểu đơn vị mở.2-guanidinobenzothiazole (GBTA, hợp chất [2] trong Hình 1a) là trước đây cho thấy có tác dụng ức chế Hv1 gần như hiệu quả như 2GBI khi được thử nghiệm ở nồng độ 200 μM (Hình 1b). Chúng tôi đã kiểm tra các dẫn xuất thiazole khác và nhận thấy rằng một số trong số chúng ức chế kênh có hiệu lực tương tự hoặc lớn hơn GBTA (Hình 1 và Phần bổ sung văn bản). Chúng tôi đã xác định đường cong phản ứng nồng độ của bốn dẫn xuất thiazole (GBTA và các hợp chất [3], [6] và [11], Hình 1c) và nhận thấy rằng chúng dốc hơn so với 2GBI. Hệ số Hill (h) của các dẫn xuất thiazole dao động từ 1,109 ± 0,040 đến 1,306 ± 0,033 (Hình 2). 1c và Hình bổ sung 1). Ngược lại, hệ số Hill cho 2GBI là 0,975 ± 0,024 29, Hình 2a và Hình bổ sung 1). Hệ số Hill trên 1 biểu thị khả năng hợp tác liên kết. Bởi vì mỗi tiểu đơn vị Hv1 có chất ức chế riêng- vị trí liên kết,29,32 chúng tôi lý luận rằng sự liên kết của dẫn xuất thiazole với một tiểu đơn vị có thể tăng cường liên kết của phân tử chất ức chế thứ hai với tiểu đơn vị liền kề.GBTA là hợp chất thử nghiệm có hệ số Hill cao nhất. Vì vậy, chúng tôi chọn hợp chất này để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phối hợp liên kết và sử dụng 2GBI làm đối chứng âm tham chiếu. (a) Hợp chất thử nghiệm: [1] Chất ức chế Hv1 tham chiếu 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-triflometyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidin, [5](4-metyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidin, [6](5-bromo-4-metyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidin, [7] famotidin, [8] 2-guanidino-5-metyl-1,3-thiazole-4-carboxylic axit etyl este, [9] 2-guanidino-4-metyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylat, [10 ](2-guanidino-4-metyl-1,3-thiazol-5-yl)etyl axetat, [11]1-[4-(4 -Clorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) Ức chế hoạt động Hv1 ở người bằng các guanidinothiazole được chỉ định và hợp chất đối chiếu 2GBI (thanh màu xanh lam) Dòng proton .Hv1 được đo trong các mảng từ trong ra ngoài của tế bào trứng Xenopus để phản ứng với quá trình khử cực từ điện thế giữ từ -80 mV đến +120 mV. Mỗi chất ức chế được thêm vào bể ở nồng độ 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Dữ liệu là giá trị trung bình±SEM (n ≥4).(c) Sự ức chế phụ thuộc nồng độ của Hv1 ở người bằng các hợp chất [2], [3], [6] và [11]. Mỗi điểm biểu thị mức ức chế trung bình ± SD của 3 đến 15 lần đo. Đường này phù hợp với Hill được sử dụng để thu được các giá trị Kd rõ ràng được báo cáo trong Bảng bổ sung 1. Các hệ số Hill được xác định từ các mức phù hợp được báo cáo trong Hình bổ sung 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (xem Phương pháp). ( a, b ) Các hợp chất 2GBI và GBTA ức chế dimeric và monome Hv1 theo cách phụ thuộc vào nồng độ. Mỗi điểm biểu thị mức ức chế trung bình ± SD của 3 đến 8 lần đo và đường cong phù hợp với Hill. Các hệ số Hill (h) được hiển thị trong biểu đồ bên trong được xác định từ mức độ phù hợp được báo cáo trong Hình bổ sung 3 và 4. Phản ứng nồng độ của GBTA được hiển thị trong (a) giống như trong Hình 1c. Xem Bảng bổ sung 1 để biết các giá trị Kd rõ ràng. (c) Mô hình hóa của liên kết hợp tác của GBTA với dimeric Hv1. Đường liền nét màu đen biểu thị sự phù hợp với dữ liệu thực nghiệm theo phương trình (6), mô tả mô hình liên kết được hiển thị trong (d). Các đường đứt nét có nhãn Sub 1 và Sub 2 biểu thị liên kết lưỡng phân tử -đường cong cân bằng phân ly của sự kiện liên kết thứ nhất và thứ hai, tương ứng (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Sơ đồ cơ chế đề xuất của khối Hv1. Trong trường hợp GBTA, liên kết với một tiểu đơn vị mở sẽ làm tăng ái lực của tiểu đơn vị mở liền kề (Kd2 0,05) so với loại hoang dã (Hình 5c), cho thấy rằng mặc dù vai trò của nó trong việc duy trì hai tiểu đơn vị cùng nhau quan trọng, nhưng CCD không trực tiếp làm trung gian liên kết liên lập thể giữa các tiểu đơn vị giữa các vị trí liên kết GBTA. ( a ) Sơ đồ của bộ điều chỉnh độ sáng Hv1 với đột biến triglycine ở đầu bên trong của S4 được thiết kế để phá vỡ sự liên kết giữa các tiểu đơn vị qua trung gian bởi miền cuộn dây tế bào chất (mũi tên màu xanh). (b) Biểu diễn sơ đồ của bộ điều chỉnh độ sáng Hv1 và bộ điều chỉnh thắt với các đột biến được chỉ định, được thiết kế để kiểm tra các đoạn S1 liên quan đến sự ghép giữa các tiểu đơn vị (mũi tên màu xanh). (c-h) 2GBI (lục lam) và GBTA (đỏ đậm) ức chế các cấu trúc được chỉ định theo cách phụ thuộc vào nồng độ. Mỗi điểm thể hiện sự ức chế trung bình ± SD từ 3 đến 10 lần đo. Đường cong là Hill fit được sử dụng để thu được các giá trị Kd rõ ràng (xem Bảng bổ sung 1). Các hệ số Hill trong biểu đồ nội suy được xác định như mô tả trong phần Phương pháp (xem Hình bổ sung 3 và 4). Giá trị h tham chiếu cho Hv1 WT được hiển thị dưới dạng đường đứt nét. Dấu hoa thị biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các đoạn đột biến và WT (p 0,05, Hình 5d, i) ). Mặt khác, đột biến D123A làm giảm đáng kể hệ số Hill của GBTA (p 0,05/14). Do việc trung hòa điện tích ở vị trí 123 trên cả hai tiểu đơn vị dẫn đến sự thay đổi mạnh mẽ về khả năng hợp tác liên kết GBTA, trong khi việc đảo ngược điện tích trên cả hai tiểu đơn vị chỉ có tác dụng nhỏ, chúng tôi đã mở rộng phân tích để chỉ bao gồm một tiểu đơn vị có kênh điện tích đảo ngược. Chúng tôi đã tạo ra các bộ điều chỉnh độ sáng liên kết với Hv1 bằng sự thay thế D123R trong tiểu đơn vị đầu C (Hình 5b) và đo mức độ ức chế phản ứng nồng độ bằng GBTA và 2GBI. Chúng tôi thấy rằng hệ số Hill của GBTA liên kết với các kênh WT-D123R cao hơn đáng kể so với cái đó của Hv1 kiểu hoang dã (p 0,05). Chúng tôi cũng nhận thấy rằng khi không có βME, hệ số Hill của GBTA liên kết với bộ điều chỉnh độ sáng D112E I127C Hv1 cao hơn đáng kể so với hệ số đo được khi có sự hiện diện của các chất khử (Hình 6e và Hình bổ sung 4), ngụ ý rằng Đột biến D112E đã không xóa bỏ sự gia tăng khả năng hợp tác liên kết GBTA do liên kết chéo của cysteine ​​​​127. Hệ số Hill của 2GBI liên kết với các bộ điều chỉnh độ sáng D112E, I127C Hv1 cũng không bị ảnh hưởng đáng kể bởi đột biến D112E (Hình 1).6d và Bổ sung Hình 3). Kết hợp lại với nhau, những phát hiện này cho thấy rằng liên kết GBTA được tăng cường nhờ sự tương tác giữa các đầu ngoài của các mảnh S1 trong các tiểu đơn vị Hv1 liền kề thông qua các tương tác tĩnh điện hấp dẫn hoặc thông qua sự hình thành liên kết cộng hóa trị giữa các cystein được thay thế. Sự liên kết dị lập thể giữa các vị trí tăng lên và dẫn đến khả năng hợp tác liên kết. Trong khi ảnh hưởng của tương tác tĩnh điện hấp dẫn đến khả năng hợp tác có thể bị loại bỏ bởi đột biến D112E, thì ảnh hưởng của liên kết cộng hóa trị lại không thể. Khi khám phá không gian hóa học có sẵn để liên kết các dẫn xuất guanidine với các kênh Hv1, chúng tôi thấy rằng 2-guanidinothiazole như GBTA có sự phụ thuộc nồng độ cao hơn so với 2-guanidinobenzimidazole (Hình 1c). Phân tích hệ số Hill của liên kết GBTA với cả dimeric và các kênh đơn phân (Hình 2a, b) và kênh dimeric trong đó một tiểu đơn vị được liên kết trước với chất ức chế (Hình 4) khiến chúng tôi kết luận rằng sự ức chế Hv1 của GBTA. Hành động này là một quá trình hiệp đồng, và vị trí liên kết của các hợp chất trong hai tiểu đơn vị được liên kết với nhau. Việc phát hiện ra rằng GBTA liên kết với kênh mở, như được trình bày trước đây đối với hợp chất liên quan 2GBI32, cho thấy rằng sự liên kết allosteric có thể được đánh giá cụ thể ở trạng thái mở. Mô hình liên kết hợp tác của chúng tôi đã có thể mô tả một cách định lượng sự ức chế Hv1 của GBTA (Hình 2c) và giải thích các tác động khác nhau của 2GBI và GBTA đối với sự phân rã của dòng đuôi kênh sau quá trình tái cực màng, hỗ trợ việc giải thích của chúng tôi về quá trình liên kết. Hệ số đồi tối đa có thể đạt được trong protein allosteric với hai vị trí liên kết (như HV1) là 2. Chúng tôi đo GBTA để liên kết loại hoang dã HV1 với hệ số 1,31, tăng lên 1,88 trong HV1 I127C. Năng lượng tự do hiệp đồng, sự khác biệt giữa năng lượng tự do liên kết của các vị trí có ái lực thấp nhất và cao nhất (xem Phương pháp), là 1,3 kcal/mol trong trường hợp loại hoang dã HV1 và 2,7 kcal/mol trong trường hợp của HV1 I127C. oxy cho hemoglobin là ví dụ nổi tiếng và được nghiên cứu kỹ lưỡng nhất về quá trình hợp tác38. Đối với hemoglobin của con người (một tetramer với bốn vị trí liên kết được kết hợp một cách phù hợp), hệ số Hill dao động từ 2,5-3.0, với các giá trị từ 1,26 đến 3,64 KCAL/mol, tùy thuộc vào các điều kiện thí nghiệm38. Vì vậy, về mặt năng lượng toàn cầu, tính hợp tác của GBTA liên kết với HV1 không khác biệt đáng kể so với liên kết với Hemoglobin khi số lượng tiểu đơn vị protein khác nhau trong hai hệ thống được xem xét. Trong mô hình sức mạnh tổng hợp của chúng tôi, sự gắn kết của các phân tử GBTA với một tiểu đơn vị dẫn đến sự gia tăng ái lực liên kết của tiểu đơn vị liền kề. Chúng tôi hình dung một quá trình sắp xếp lại môi trường ràng buộc do sự kiện liên kết đầu tiên (phù hợp) dẫn đến những thay đổi về sự tương tác giữa các tiểu đơn vị. Trong phản ứng với những thay đổi này, các tiểu đơn vị liền kề thay đổi các vị trí liên kết của chúng, dẫn đến ràng buộc GBTA chặt chẽ hơn. Xử lý quá trình này, S1 aspartate D112 chịu trách nhiệm sắp xếp lại vị trí liên kết liên quan đến tăng ái lực liên kết.D112 trước đây đã được chứng minh là một phần của con đường thấm proton HV1 và đóng vai trò là bộ lọc chọn lọc27,28. Kết quả của chúng tôi cho thấy các bộ lọc chọn lọc trong hai tiểu đơn vị HV1 được kết hợp hoàn toàn ở trạng thái mở. Hình 7A cho thấy vị trí gần đúng của vị trí liên kết GBTA và vị trí của dư lượng D112, D123, K125 và I127 trên sơ đồ của HV1 VSD dựa trên HV1 Trên cấu trúc tinh thể của chimera HV1-CIVSP. Các hướng dẫn được điều trị cho khớp nối allosteric liên quan đến đầu ngoại bào của S1 được hiển thị với mũi tên màu đen. . Các vị trí dự đoán của GBTA bị ràng buộc được hiển thị dưới dạng hình bầu dục màu xám. Mũi tên chỉ ra các con đường liên quan đến khớp nối allosteric giữa các vị trí liên kết trong hai tiểu đơn vị liền kề. Trong hai cấu hình dimer khác nhau được nhìn từ phía ngoại bào của mặt phẳng màng. Trên bảng điều khiển bên trái, giao diện dimer được hình thành bởi Helix S4. Tách các đầu ngoài của hai vòng xoắn S4 (mũi tên đứt nét), tạo ra sự sắp xếp được hiển thị ở bên phải. Trong cấu hình này, dư lượng D123 và I127 từ các tiểu đơn vị liền kề được phép đến gần nhau. Trong cấu hình dimer hơn được tìm thấy trong cấu trúc tinh thể 4G80.Pocation p140 trong civsp tương ứng với vị trí D123 trong HV1. Kết quả của chúng tôi cho thấy sự tương tác tĩnh điện đẩy giữa dư lượng 123 (123D/123D hoặc 123R/123R) được liên kết với mức độ hợp tác liên kết GBTA "bình thường" ở trạng thái mở và chuyển sự tương tác từ lực đẩy sang thu hút (123D/123R) , Tăng hợp tác (Hình 5G). dự kiến ​​sẽ loại bỏ sự tương tác chống lại sự thay thế alanine cũng sẽ dẫn đến tăng tính hợp tác. Tuy nhiên, việc giảm tính hợp tác của độ mờ 123a/123a đã được quan sát (Hình 5E). Giải thích là hiệu ứng gây bất ổn của việc đặt dư lượng kỵ nước trong môi trường ưa nước có thể vượt trội hơn hiệu ứng ổn định do loại bỏ các tương tác đẩy giữa các dư lượng D123, dẫn đến giảm khả năng hợp tác liên kết. Vị trí D171 của Ciona Gutis CI-HV1 (tương ứng với D123 trong HV1 của con người) được tăng lên khi kích hoạt, hỗ trợ cho khái niệm D123 nằm trong môi trường ưa nước ở trạng thái mở. Gating của các kênh HV1 được biết là xảy ra thông qua nhiều lần chuyển tiếp19,20,26,39,40,41.Qiu et al26 đã phát hiện ra rằng khi khử cực màng, cảm biến điện áp của CI-HV1 trải qua sự thay đổi hình dạng khiến kênh được kích hoạt nhưng vẫn đóng , tiếp theo là một quá trình chuyển đổi khác biệt làm cho các proton mở ra trong cả hai đường dẫn tiểu đơn vị. Sự thay đổi về hình dạng của cảm biến điện áp được theo dõi bằng huỳnh quang đóng đinh điện áp, và người ta thấy rằng quá trình chuyển đổi thứ hai bị nhiễu loạn một cách có chọn lọc do đột biến ở vị trí D171. Sự nhiễu loạn của tín hiệu huỳnh quang phù hợp với sự hiện diện của các tương tác tĩnh điện giữa các dư lượng D171 của các tiểu đơn vị liền kề tại một số điểm dọc theo tọa độ phản ứng của sự thay đổi hình dạng. và trung gian khớp nối allosteric giữa các vị trí ràng buộc GBTA. Fujiwara et al25 đã đề xuất rằng giao diện dimer của miền cuộn dây tế bào chất mở rộng vào màng để chứa hai vòng xoắn S4 (Hình 7B, bảng điều khiển bên trái). Toàn bộ VSD và phân tích chức năng của vùng kết nối chuỗi xoắn S4 và CCD. Trong việc không có độ dốc pH xuyên màng, các kênh HV1 yêu cầu khử cực màng đáng kể để mở và liên kết chéo cysteine ​​xảy ra trong điều kiện kênh chủ yếu đóng lại. Do đó, giao diện S4-S4 được phát hiện có khả năng phản ánh cấu hình tiểu đơn vị ngoài trạng thái. Các nghiên cứu khác đã tìm thấy bằng chứng cho sự tham gia của S1 và S2 trong các tương tác liên ngành trong Gating17,21,26 cho thấy các kênh có thể áp dụng các cấu hình tiểu đơn vị khác nhau trong Mở và Các quốc gia khép kín, một ý tưởng phù hợp với những phát hiện của Mony et al. S1 di chuyển 39 trong quá trình gating. Ở đây, chúng tôi chỉ ra rằng, ở trạng thái mở, các đầu ngoại bào của chuỗi xoắn S1 đủ gần để hỗ trợ các tương tác tĩnh điện trực tiếp làm trung gian cho khớp nối allosteric giữa các tiểu đơn vị. Ngoài nhau để tương tác trực tiếp. Tuy nhiên, một vòng quay theo chiều kim đồng hồ 20 ° theo chiều kim đồng hồ 20 ° xung quanh một trục vuông góc với mặt phẳng màng với những phát hiện của chúng tôi (Hình 7b, bảng bên phải). Chúng tôi đề xuất cấu hình này cho kênh ở trạng thái mở. Mặc dù enzyme civsp được cho là hoạt động như một monome, nhưng cấu trúc tinh thể của VSD bị cô lập của nó được chụp ở trạng thái mờ hơn. Đối với HV1 (Hình 7C). Trong bộ dimer Civsp, dư lượng gần nhất từ ​​tiểu đơn vị liền kề là proline ở vị trí 140 (Hình 7C). TUYỆT VỜI, P140 trong CIVSP tương ứng với vị trí D123 trong HV1. và các chất làm mờ CIVSP cho thấy rằng VSD của các protein này có xu hướng nội tại để tạo thành một giao diện trong đó các đầu ngoại bào của S1 tương tác. Vai trò thiết yếu của HV1 trong kích hoạt tế bào tinh trùng làm cho kênh này trở thành mục tiêu thuốc hấp dẫn để kiểm soát khả năng sinh sản của nam giới. Sự sống sót ở bệnh nhân mắc bệnh ung thư vú 12 hoặc ung thư đại trực tràng 13 và được cho là góp phần vào khối u ác tính tế bào B 11. Do đó, các loại thuốc phân tử nhỏ nhắm mục tiêu HV1 có thể được sử dụng làm tác nhân bảo vệ thần kinh hoặc điều trị bằng thuốc chống ung thư. Tiểu đơn vị HV1 mở, dẫn đến tăng ái lực ràng buộc, có thể dẫn đến sự phát triển của các loại thuốc mạnh hơn nhắm mục tiêu các kênh HV1. Đột biến theo hướng địa điểm của HV1 ở người được thực hiện bằng các kỹ thuật PCR tiêu chuẩn. Trong cấu trúc HV1NCCCIVSP, dư lượng 1-96 và 228-273 của HV1 đã được thay thế bằng dư lượng 1-113 và 240-576 Terminus C của một tiểu đơn vị được liên kết với đầu cuối N của tiểu đơn vị thứ hai thông qua trình liên kết GGSGGSGSGSGGSGG. Bộ phiên mã MMACHINE T7 mmessage (Ambion) .1-3 ngày trước khi đo điện sinh lý, CRNA được tiêm vào tế bào trứng Xenopus (50 NL mỗi tế bào, 0,3-1,5 g/μl). Từ sinh học tế bào sinh thái. Theo dõi RNA, các tế bào được duy trì trong môi trường ND96 chứa 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl, 1 mM mgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvate, 100 g/ml . 2-Guanidino-Benzimidazole [1], 2-Guanidino-Benzothiazole [2], (4-methyl-1,3-Thiazol-2-yl) guanidine [5], (5-bromo-4 -methyl-1,3 -thiazol-2-yl) guanidine) [6], ethyl 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiiazole-4-carboxylate [8], ethyl 2-guanidino-4 5-carboxylate [9] và (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiiazol-5-yl) ethyl acetate [10] là từ sigma-aldrich.famotidine [7] là từ MP Biomedical.1- [4 -(4-chlorophenyl) -1,3-thiazol-2-yl] guanidine [11] và 1- [4- (3,4-dimethoxyphenyl) -1,3- thiazol-2-yl] guanidine [12] từ ma trận khoa học. Các hợp chất này có độ tinh khiết cao nhất có sẵn trên thị trường. Chúng được hòa tan trong DMSO khô để tạo ra dung dịch gốc 100 mM, sau đó được pha loãng trong dung dịch ghi ở nồng độ cuối cùng mong muốn. ít nhất 99% độ tinh khiết. Để đình chỉ 2-amino-4- (trifluoromethyl) benzenethiol hydrochloride (1,02 g, 4,5 mmol) trong 25 ml axit hydrochloric dung dịch nước (2,5 N) được hồi lưu với sự khuấy mạnh trong 4 giờ. Hỗn hợp phản ứng được làm mát đến nhiệt độ phòng và trung hòa bằng cách thêm 10N kali hydroxit. Kết tủa trắng được hình thành được lọc, rửa bằng nước lạnh (3 × 50 ml), sấy khô trong lò nướng ( 65 ° C) trong vài giờ, sau đó kết tinh lại từ ethyl acetate/ether dầu mỏ để tạo ra một chất rắn trắng (500 mg, 48 %); MP 221 Từ222 ° C (ánh sáng 225 Hàng226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): [ppm] = 7,25 (rất rộng s, 4 h), 7,40 (d, 1 h, j = 8.1 Hz), 7,73 (s, 1 h), 7,92 (d , 1 H, J = 8.1 Hz) .13c NMR (200 MHz, DMSO-D6): = 114.2 (D, J = 3,5 Hz), 117,5 (D, J = 3,5 Hz) = 272 Hz), 126.1 (Q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): M/Z Giá trị tính toán. : 261.0419. Naphtho [1,2-d] thiazol-2-amine (300 mg, 1,5 mmol), được tổng hợp như mô tả trước đây, đã được làm nóng đến 200 ° C trong bể dầu trong ống nghiệm nhỏ.300 mg (dư thừa lớn) Cyanamide và 1.0 ml conc.to Hợp chất nóng được thêm axit clohydric nhanh chóng và hỗn hợp được giữ trong bể dầu trong khoảng 2 phút, trong thời gian đó hầu hết nước bốc hơi. được chia thành các mảnh nhỏ và rửa bằng nước để cung cấp một chất rắn vô định hình màu vàng nhạt. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [ppm] = 7,59 (t, 1 h, j = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 h, j = 8,3 Hz), 7,77 (D, 1 h , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 h, j = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 h, j = 8.2 Hz), 8,35 (d, 1 h, j = 8.3 Hz). MHz, DMSO-D6): Δ = 119,9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): Giá trị tính toán của M/Z. , tìm thấy: 243.0704. Các dòng proton được đo bằng các bản vá tế bào trứng bên trong và bên ngoài biểu thị các cấu trúc khác nhau bằng cách sử dụng bộ khuếch đại Axopatch 200B được điều khiển bởi một axon digidata 1440a (thiết bị phân tử) với phần mềm pclamp10. ) Axit Ethanesulfonic (MES), 30 mM tetraethylammonium (TEA) mesylate, 5 mm TEA clorua, 5 mm ethylene glycol-bis (2-aminoethyl) -n pH 6.0 với trà hydroxit. Tất cả các phép đo được thực hiện ở 22 ± 2 ° C. Pipet có điện trở truy cập là 1,5 Nott4 MΩ. ) và Origin8.1 (OriginLab). Các giải pháp chứa nồng độ khác nhau của chất ức chế HV1 và trong một số trường hợp, 10 mM đã được đưa vào bể bằng trọng lực thông qua một đa dạng kết nối với hệ thống van tưới máu VC-6 (Warner uster.) Logic bóng bán dẫn) Tín hiệu. Thí nghiệm tưới máu đã được thực hiện bằng cách sử dụng bút chì tưới máu đa ống (tự động SCI.) Với đầu phân phối đường kính 360 μm được gắn phía trước một pipet bản vá. Các phép đo xung khử cực +120 mV đã được thực hiện như mô tả trước đây18,20. Dòng điện được ghi lại ở -40 mV sau các bước khử cực ở các điện áp khác nhau từ -20 mV đến +120 mV trừ khi có quy định khác. Được sử dụng để điều chỉnh cho sự phân rã hiện tại 18. Đồ thị GV phù hợp với phương trình Boltzmann: Hằng số phân ly rõ ràng (KD) cho các kết hợp các kênh và chất ức chế khác nhau (Bảng bổ sung 1) được xác định bằng cách phù hợp Với phương trình đồi: trong đó [i] là nồng độ của chất ức chế I và H là hệ số đồi. Để tính hệ số đồi, phương trình (2) được sắp xếp lại là: