Ifọrọwanilẹnuwo ti wiwo intersubunit ti ikanni proton Hv1 ṣiṣi pẹlu iwadii idapọmọra alapọpo

O ṣeun fun lilo si Nature.com.Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin to lopin fun CSS.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri ti a ṣe imudojuiwọn (tabi pa ipo ibaramu ni Internet Explorer) lakoko, lati rii daju tesiwaju support, a yoo han ojula lai aza ati JavaScript. Awọn ikanni proton foliteji-gated Hv1 jẹ eka dimeric ti o wa ninu awọn ibugbe ifarabalẹ foliteji meji (VSDs), ọkọọkan ninu eyiti o ni ipa-ọna proton permeation gated. Dimerization ti wa ni iṣakoso nipasẹ agbegbe cytoplasmic coiled-coil.Iyipo lati ipo pipade si ipinle ti o ṣii ni awọn VSD mejeeji ni a mọ lati waye ni ifowosowopo; sibẹsibẹ, diẹ ni a mọ nipa awọn ọna ṣiṣe. sibẹsibẹ, iru awọn atọkun ko ti mọ ni awọn ikanni Hv1 ti o ṣii.Nibi a ṣe afihan pe awọn itọsẹ 2-guanidinothiazole ṣe idiwọ Hv1 VSD meji ni ọna ifowosowopo ati lo ọkan ninu awọn agbo ogun wọnyi gẹgẹbi iwadii fun idapọ allosteric laarin awọn ṣiṣafihan ṣiṣi.A ri pe extracellular extracellular. opin ajẹkù transmembrane akọkọ ti VSD ṣe agbekalẹ wiwo intersubunit ti o ṣe agbedemeji isọpọ laarin awọn aaye abuda, lakoko ti agbegbe coil-coil ko ni ipa taara ninu ilana yii. . Awọn ikanni proton foliteji-gated ṣe awọn ipa pataki ni ọpọlọpọ awọn oganisimu, lati phytoplankton si eniyan1.Ni ọpọlọpọ awọn sẹẹli, awọn ikanni wọnyi n ṣe agbedemeji proton efflux lati inu awo proton ati ṣe ilana iṣẹ ṣiṣe ti NADPH oxidase.Awọn ikanni proton foliteji-gated nikan ti a mọ ninu eniyan. jẹ Hv1, ti o jẹ ọja ti HVCN1 gene2,3.Hv1 (aka VSOP) ti ṣe afihan lati ṣe ipa ninu ilọsiwaju B cell4, iṣelọpọ ti awọn ẹya atẹgun ti o ni ifaseyin nipasẹ eto ajẹsara ti ajẹsara5,6,7,8, sperm cell motility9 ati ilana pH ti oju omi oju-ofurufu10. Ikanni yii ni ipa ninu ọpọlọpọ awọn Overexpressed ni awọn iru akàn gẹgẹbi B-cell malignancies4,11 ati igbaya ati awọn aarun awọ-awọ12,13.Iwọn iṣẹ Hv1 ti o pọju ni a ri lati mu ilọsiwaju ti iṣelọpọ ti awọn sẹẹli alakan 11, 12.Ninu ọpọlọ, Hv1 ti han nipasẹ microglia, ati iṣẹ rẹ ti han lati mu ibajẹ ọpọlọ pọ si ni awọn awoṣe ti ọpọlọ ischemic. Awọn amuaradagba Hv1 ni agbegbe ti o ni imọ-foliteji (VSD), eyiti o ni awọn apakan transmembrane mẹrin ti a pe ni S1 si S414. VSD jọmọ awọn ibugbe ti o baamu ti foliteji-gated Na +, K + ati awọn ikanni Ca2 + ati awọn phosphatases ifamọ foliteji, gẹgẹbi CiVSP lati Ciona gutis15.Ninu awọn ọlọjẹ miiran, C-terminus ti S4 ti wa ni asopọ si module ipa, agbegbe pore tabi enzymu.Ni Hv1, S4 ti sopọ mọ agbegbe coiled-coil (CCD) ti o wa ni ẹgbẹ cytoplasmic ti awo ilu. .Ikanni naa jẹ eka dimeric kan ti o ni awọn VSD meji, ọkọọkan ti o ni ipa-ọna proton permeation gated16,17,18. Awọn wọnyi meji Hv1 subunits ni a ri lati ṣii cooperatively19,20,21,22, ni iyanju pe allosteric coupling ati inter-subunit ibaraenisepo mu ṣiṣẹ. ipa ti o ṣe pataki ninu ilana ẹnu-ọna.Iwọn wiwo laarin awọn ipin laarin awọn agbegbe ti o wa ni agbegbe ti o ni okun ti a ti sọ di mimọ jẹ asọye daradara nitori awọn ẹya ara gara ti awọn agbegbe ti o ya sọtọ meji wa22,23. Ni apa keji, wiwo laarin awọn VSD laarin awo-ara ko ni daradara understand.The gara be ti Hv1-CiVSP chimeric amuaradagba ko ni pese alaye nipa yi ni wiwo, bi trimeric agbari ti awọn crystallized ikanni eka le ja si lati awọn rirọpo ti abinibi Hv1 CCD nipasẹ awọn iwukara leucine idalẹnu GCN424. Iwadi kan laipe kan ti ẹgbẹ ipin ti ikanni Hv1 pari pe awọn iyipada S4 meji si CCD laisi idalọwọduro nla ti eto ile-ẹkọ keji, ti o yọrisi awọn helices gigun ti o bẹrẹ lati awo awọ ati iṣẹ akanṣe sinu cytoplasm.Da lori itupalẹ ọna asopọ agbelebu cysteine, iwadi yi tanmo wipe Hv1 VSDs kan si kọọkan miiran pẹlú awọn S4 apa.Sibẹsibẹ, miiran-ẹrọ ti dabaa yiyan atọkun laarin VSDs.These ni wiwo ni S1 apa 17, 21, 26 ati awọn lode opin ti S2 apa 21.A ṣee ṣe idi fun awọn rogbodiyan. Awọn abajade ti awọn ijinlẹ wọnyi ni pe a ṣe ayẹwo idapọ allosteric laarin awọn VSD ni ibatan si ilana gating, eyiti o da lori awọn ipinlẹ pipade ati ṣiṣi, ati wiwo laarin awọn VSD le yatọ ni awọn iyipada ipinlẹ oriṣiriṣi ni ibamu. Nibi, a rii pe 2-guanidinothiazole ṣe idiwọ awọn ikanni Hv1 nipasẹ isunmọ synergistically si awọn VSD meji ti o ṣii, ati lo ọkan ninu awọn agbo ogun, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), lati ṣe iwadii ibaraenisepo laarin awọn subunits ni ipo ṣiṣi. interface.We ri wipe GBTA abuda ti tẹ le ti wa ni daradara apejuwe nipasẹ a pipo awoṣe ninu eyi ti abuda ti ohun inhibitor si ọkan subunit esi ni ilosoke ninu awọn abuda ijora ti awọn nitosi subunit.We tun ri wipe awọn iṣẹku D112, selectivity Ajọ fun awọn ikanni 27, 28 ati apakan ti guanidine itọsẹ abuda abuda 29 Iṣakoso GBTA abuda cooperativity. A fihan pe ajumose abuda ti wa ni muduro ni Hv1 dimer, ibi ti awọn CCD ya lati S4 apa, ni iyanju wipe intersubunit ni wiwo ni CCD ko ni taara mediate allosteric coupling laarin GBTA-abuda sites.Ni idakeji, a ri pe S1 ajẹkù jẹ apakan ti wiwo laarin awọn subunits ati ki o dabaa ohun akanṣe ti awọn VSD ti o wa nitosi pẹlu awọn extracellular opin ti S4 helix kuro lati aarin ti dimer lati gba laaye. Ajẹkù S1 lati wa ni ipo ṣiṣi. Awọn inhibitors molecule kekere ti Hv1 wulo bi awọn oogun anticancer ati awọn aṣoju neuroprotective.Sibẹsibẹ, titi di oni, awọn agbo ogun diẹ ti ni anfani lati dena ikanni30,31,32,33. Lara wọn, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, compound [1] ni Ọpọtọ . tẹlẹ fihan lati dojuti Hv1 fere bi daradara bi 2GBI nigba idanwo ni ifọkansi ti 200 μM (Figure 1b) .A ṣe ayẹwo awọn itọsẹ thiazole miiran ati pe diẹ ninu wọn ṣe idiwọ ikanni pẹlu iru tabi agbara ti o tobi ju GBTA (Fig. 1 ati Afikun afikun). text) .A ṣe ipinnu awọn iṣiro esi ifọkansi ti awọn itọsẹ thiazole mẹrin (GBTA ati awọn agbo ogun [3], [6] ati [11], eeya. ti awọn itọsẹ thiazole wa lati 1.109 ± 0.040 si 1.306 ± 0.033 (Eeya. 1c ati Àfikún Ọpọtọ Aaye abuda, 29,32 a ro pe sisopọ itọsẹ thiazole si ipin kan le mu imudara moleku inhibitor keji pọ si subunit ti o wa nitosi.GBTA ni apopọ idanwo pẹlu iyeida Hill ti o ga julọ.Nitorina, a yan agbo-ara yii si siwaju iwadi awọn siseto ti abuda amuṣiṣẹpọ ati ki o lo 2GBI bi a itọkasi odi Iṣakoso. (a) Awọn agbo ogun idanwo: [1] Reference Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl) guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5] (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl) guanidine, [6] (5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl) guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10] ] (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) ethyl acetate, [11] 1-[4- (4 -Chlorophenyl) -1,3-thiazol-2-yl] guanidine, 12]. .Hv1 proton currents ni a ṣe iwọn ni inu-jade plaques ti Xenopus oocytes ni idahun si depolarization lati agbara idaduro ti -80 mV si + 120 mV. A ṣe afikun inhibitor kọọkan si iwẹ ni ifọkansi ti 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .Data jẹ tumọ ± SEM (n≥4) . (c) Ifojusi-igbẹkẹle ti o gbẹkẹle Hv1 eniyan nipasẹ awọn agbo ogun [2], [3], [6] ati [11] . Ojuami kọọkan ṣe afihan idinamọ ± SD ti 3 to 15 wiwọn. Laini naa jẹ ibamu Hill ti a lo lati gba awọn iye Kd ti o han gbangba ti o royin ni Tabili Iyọkuro 1. Awọn aṣodisi Hill ni a pinnu lati awọn ibamu ti a royin ni Aworan Afikun. 1: h (1) = 0.975 ± 0.024 h (2) = 1.306 ± 0.033, h (3) = 1.25 ± 0.07, h (6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (wo Awọn ọna). (a,b) Awọn akojọpọ 2GBI ati GBTA ṣe idiwọ dimeric ati monomeric Hv1 ni ọna ti o gbẹkẹle igbẹkẹle. Ojuami kọọkan n ṣe afihan idinamọ ± SD ti 3 si awọn wiwọn 8 ati iṣipopada jẹ Hill fit. Awọn iṣiro Hill (h) ti o han ni Awọn histogram inset ni a pinnu lati awọn ibamu ti a royin ni Awọn Figs Afikun 3 ati 4. Idahun ifọkansi ti GBTA ti o han ni (a) jẹ kanna bii ti o wa ni aworan 1c.Wo Iyọkuro Tabili 1 fun awọn iye Kd ti o han gbangba.(c) Awoṣe ti awọn ajumose abuda GBTA to dimeric Hv1. Awọn ri to dudu ila duro awọn fit si awọn esiperimenta data nipa idogba (6), eyi ti o se apejuwe awọn abuda awoṣe han ni (d) . Awọn laini dashed ike Sub 1 ati Sub 2 soju fun awọn bimolecular sepo. -dissociation equilibrium ekoro ti akọkọ ati keji iṣẹlẹ abuda, lẹsẹsẹ (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O *, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM .(d) Aworan atọka ti ilana ti a dabaa ti block Hv1. Ninu ọran GBTA, didi si ipin-iṣiro kan ti o mu ki isunmọ ti agbegbe ṣiṣi ti o wa nitosi (Kd2 Awọn ikanni Hv1 le jẹ monomerized nipasẹ rirọpo awọn ibugbe cytoplasmic N- ati C-terminal wọn pẹlu awọn ipin ti o baamu ti Ciona Intestinalis foliteji-sensitive phosphatase CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18,34.We wiwọn igbẹkẹle ifọkansi ti idinamọ ti monomeric Hv2GBI ati GBTA ati akawe wọn si ti dimeric ikanni (egan-Iru) idinamọ (Fig. 2a,b) .A ri pe awọn iyato ninu abuda cooperativity laarin awọn meji agbo ti a kuro ni monomeric Hv1, ni atilẹyin awọn alaye ti GBTA abuda si ọkan subunit mu ki awọn Ibaṣepọ ti ipin miiran fun inhibitor.A pinnu pe asopọ GBTA si apakan Hv1 kan le ja si atunto aaye isọdọkan (inducing fit35), eyiti yoo fa atunto aaye isọdọkan ti o ṣofo ti ipin ti o wa nitosi, ti o yori si isọdọkan pọ si. ijora. Lati ṣe apejuwe ni iwọn ni iwọn isọdọkan ifowosowopo ti GBTA si ikanni, a lo awoṣe kan ninu eyiti boya subunit le di moleku inhibitor akọkọ ti o tẹle ifasẹ bimolecular pẹlu ipinya igbagbogbo Kd1 (Fig. 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO *). Asopọmọra jẹ ki ikanni gba ipo kan ninu eyiti awọn ipin ti o ṣofo ti o wa ni asopọ si inhibitor ti o tẹle ipadasẹhin bimolecular alailẹgbẹ pẹlu Kd2 igbagbogbo dissociation, nibiti Kd2 Ni kete ti a ti so molikula inhibitor keji, awọn ipin mejeeji ni ipinya nigbagbogbo Kd2 (Fig. 2d) .Iwọn idinamọ ikanni labẹ awọn ipo irẹwẹsi (+ 120 mV) . Awọn eya ikanni pẹlu ọkan ṣiṣi ati ipin kan ti o ni pipade (wo iyipada CC ⇄ OC ⇄ OO ni eeya 2d) ni a rii tẹlẹ lati ṣe alabapin ni aifiyesi si lọwọlọwọ Hv1 labẹ awọn ipo wọnyi19,20 ati nitorinaa wọn ko wa ninu awoṣe abuda. Laini dudu ti o lagbara ni Nọmba 2c ni ibamu ti idogba awoṣe si igbi-idahun ifọkansi esiperimenta, ti nso Kd1 ti ~ 290 μM ati Kd2 ti ~ 29 μM (Awọn ọna ọna, idogba (6)) .Awoṣe naa tun ṣe apejuwe abuda ti 2GBI, nibiti Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d) .Ni monomeric Hv1, aaye kan soso wa ati Kdm kan (O ° + B ⇆ B°) .Ninu ọran GBTA, Kdm wa ni ayika 54. μM, eyiti o jọra si Kd1 ju Kd2 (Fig. 2d) .Ni awọn ọrọ miiran, aaye abuda ti monomer wa ni iṣeto ni (O °) diẹ sii si ipo isunmọ giga (BO *) ju kekere- ipo ijora (OO) ti dimer, o ṣeeṣe julọ nitori imukuro wiwo laarin awọn ipin. Gẹgẹbi a ti han tẹlẹ fun 2GBI32, a rii pe GBTA ti tẹ awọn ṣiṣan Hv1 kuro nipa didi ikanni naa nigbati o ṣii ju nipa ṣiṣe ki o nira sii lati ṣii (Fig. ni esi to awopọ repolarization, sugbon yi lasan ti ko ba šakiyesi ni GBTA (Afikun Ọpọtọ. 2c) .Ni niwaju Hv1 inactivation ni niwaju 2GBI, awọn ẹnu-bode ni kọọkan subunit ko le pa titi di blocker fi kuro ni abuda ojula (awọn "awọn" ẹsẹ ẹnu-bode” siseto), ati 2GBI unbinds losokepupo ju awọn ẹnu-bode sunmọ.Ti o ba ti ọkan Hv1 subunit ti wa ni unblocked ati ki o pipade, nigba ti awọn nitosi subunit si maa wa dina, unbinding ti awọn ti o ku 2GBI moleku di losokepupo (blocker Yaworan).Log-ti gbé ikanni eya pẹlu Ẹyọ kan ṣoṣo ti o dina ni subunit iwa awọn protons laipẹ ṣaaju pipade ati ṣe ilowosi pataki si lọwọlọwọ iru ibajẹ laiyara. Wiwa pe ibajẹ ti awọn ṣiṣan iru Hv1 ko dinku ni pataki ni iwaju GBTA (Afikun 2c) jẹ ibamu pẹlu ilana isunmọ amuṣiṣẹpọ fun blocker yii (Fig. 2d) , Ibaṣepọ ti blocker si ẹgbẹ ti o wa nitosi ṣubu nipa 10-agbo, ti o ṣe itẹwọgba ilana ti a ko le ṣe.Eyi tumọ si pe moleku keji ti GBTA ni anfani ti o ga julọ ti ṣiṣi silẹ ṣaaju ki o to ni idẹkùn ni ikanni. gbe awọn kan nikan ìdènà subunit ti wa ni o ti ṣe yẹ lati wa ni Elo siwaju sii lọpọlọpọ ni niwaju GBTA ju niwaju 2GBI, Abajade ni yiyara iru lọwọlọwọ ibajẹ. Ni ibere fun GBTA lati dipọ ni ifọwọsowọpọ pẹlu awọn ipin Hv1 mejeeji, awọn aaye abuda gbọdọ jẹ alapọpo. Aaye abuda kọọkan gbọdọ ni agbara lati: 1) nfa pq ti awọn iṣẹlẹ ti o ṣe ibasọrọ pẹlu awọn ipin ti o wa nitosi ti a dè si inhibitor, ati 2) ti o ṣe alarina iyipada lati kekere-ibaraẹnisọrọ to ga-ibaramu binding.A ro wipe ti o ba ti pato awọn iṣẹku laarin awọn abuda ojula tiwon si awọn ajumose ilana, wọn iyipada yẹ ki o paarọ awọn Hill olùsọdipúpọ ti awọn ifọkansi-idahun ti tẹ GBTA idinamọ ti Hv1.Residues D112, F150 , S181 ati R211 ni a fihan tẹlẹ lati jẹ apakan ti agbegbe 2GBI29 abuda ati pe a ṣe akiyesi pe wọn yoo ni ipa kanna ni asopọ GBTA (Fig. 3A) . A ṣe iwọn awọn ifọkansi-idahun inhibitory GBTA fun awọn ikanni mutant D112E, F150A, S181A , ati R211S (Nọmba 3) ati ki o ṣe afiwe awọn iyeida Hill wọn si awọn ti Hv1 egan-iru, lilo 2GBI gẹgẹbi itọkasi.Residue V109 wa ni oju kanna ti S1 apa bi D112 ati pe o ni ọkan afikun helical tan inu cell.Niwon V109 ko ṣe alabapin ninu isọdọkan ti 2GBI29, a lo ẹda V109A bi iṣakoso (Eeya. 3b). (a) Awọn iṣẹku Hv1 ti o ni imọran ti o ni ipa ninu binding itọsẹ guanidine. Awọn igun buluu ti a fi silẹ ni ayika awọn ẹwọn ẹgbẹ ti a ti pinnu tẹlẹ ti o nlo pẹlu awọn ẹya oriṣiriṣi ti agbo 2GBI29. pupa dudu) Awọn histogram inset ni a pinnu lati awọn ibamu ti a royin ni Awọn afikun Figs 3 ati 4. Awọn iye itọkasi h fun Hv1 WT ni a fihan bi awọn laini didasi.Asterisks tọkasi awọn iyatọ pataki ti iṣiro laarin awọn mutant ati awọn aye WT (p 0.05, Fig. 5d,i) ). Ni ida keji, iyipada D123A ṣe pataki dinku iye-iye Hill ti GBTA (p 0.05/14). Niwọn igbati didoju idiyele ni ipo 123 lori awọn ipin mejeeji yorisi iyipada to lagbara ni ifowosowopo isopọmọ GBTA, lakoko ti o yi idiyele idiyele lori awọn ipin mejeeji ni ipa kekere nikan, a fa igbekalẹ naa pọ si pẹlu ipin kan ṣoṣo pẹlu ikanni inversion ti idiyele.We ti ipilẹṣẹ Hv1-ti sopọ dimers pẹlu D123R fidipo ni C-terminal subunit (Fig. 5b) ati ki o wọn ifọkansi-idahun idawọle nipa GBTA ati 2GBI.A ri pe awọn Hill olùsọdipúpọ ti GBTA abuda to WT-D123R awọn ikanni jẹ significantly ti o ga ju pe ti Hv1-iru-igi (p 0.05). A tun rii pe ni isansa ti βME, iyeida Hill ti GBTA abuda si D112E I127C Hv1 dimer jẹ pataki ti o ga ju eyiti a ṣewọn niwaju awọn aṣoju idinku (Fig. 6e ati Aworan Apọju. 4), ti o tumọ si pe iyipada D112E ko fopin si ilosoke ninu GBTA binding cooperativity Abajade lati awọn ọna asopọ agbelebu ti cysteine ​​​​127. The Hill olùsọdipúpọ ti 2GBI abuda to D112E, I127C Hv1 dimers ti a tun ko ni ipa pataki nipasẹ iyipada D112E (Figure 1) .6d ati Afikun aworan 3). Papọ, awọn awari wọnyi daba pe asopọ GBTA jẹ imudara nipasẹ ibaraenisepo laarin awọn opin ita ti awọn ajẹkù S1 ni isunmọtosi Hv1 ti o wa nitosi nipasẹ awọn ibaraenisọrọ elekitirosi ti o wuyi tabi nipasẹ dida awọn ifunmọ covalent laarin aropo cysteines Allosteric idapọ laarin awọn alekun awọn aaye ati awọn abajade ni mimu ifowosowopo. Lakoko ti ipa ti awọn ibaraenisepo elekitirotatiki lori ifọwọsowọpọ le paarẹ nipasẹ iyipada D112E, ipa ti awọn iwe ifowopamosi covalent ko le. Ninu iwadi wa ti aaye kemikali ti o wa fun sisọ awọn itọsẹ guanidine si awọn ikanni Hv1, a ri pe 2-guanidinothiazoles bi GBTA ni igbẹkẹle ifọkansi ti o ga ju 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c) .Itupalẹ onisọpọ Hill ti GBTA abuda si mejeji dimeric. ati awọn ikanni monomeric (Fig. 2a,b) ati si ikanni dimeric ninu eyiti ọkan subunit ti wa ni iṣaju ti a ti sopọ si inhibitor (Fig. 4) mu wa pinnu pe idinamọ Hv1 nipasẹ GBTA Iṣẹ naa jẹ ilana imuṣiṣẹpọ, ati awọn aaye abuda ti awọn agbo ogun ti o wa ninu awọn ipele meji ti o wa ni alapọpọ. Awari ti GBTA sopọ mọ ikanni ti o ṣii, gẹgẹbi a ti han tẹlẹ fun 2GBI32 ti o ni ibatan, ni imọran pe a le ṣe ayẹwo idapọmọra allosteric ni pato ni ipo-ìmọ. Ni anfani lati ṣalaye idiwọn ti HV1 nipasẹ Gbta (Fig. 2C) ati pe o ṣe alaye itumọ ti ilana isọnu wa. O pọju alagidija to gaju ti o le ṣaṣeyọri ninu awọn aaye imukuro meji (bii HV1) jẹ iwọn GB1 Agbara Synergistic, iyatọ laarin awọn aaye to ṣofintoto fun awọn aaye ọfẹ ti o kere julọ ti o kere julọ ati 27 Kc-iru ati 2.7 Kc-di iru HV1 I127C.Tin ti atẹgun si Hemoglobin jẹ apẹẹrẹ ti o gbajumọ julọ ati ti a fiweranṣẹ daradara ti awọn aaye iṣọpọ: KCAL / Mol, da lori awọn ipo esiperimental38.Thes, ni awọn ofin ti awọn agbara agbaye, Coodeter ti o yatọ si Hv1 ko ni idamu ti Oogo ti o yatọ si Hemoglobin nigbati awọn nọmba oriṣiriṣi ti awọn ilana subsin ni awọn ọna ṣiṣe meji ni awọn ọna ṣiṣe meji ni a ka. Ninu awoṣe synergnu wa, fifọ awọn abajade gtas fun awọn abajade arekereke kan ni ilolu ti agbegbe ibimọ ti a ṣe ilana ti agbegbe idena (fifin akọkọ ki o jẹ ki o jẹ ki o jẹ ki o jẹ ki o jẹri) ṣe afihan ibaamu akọkọ Awọn ayipada ninu awọn ibaraenisepo laarin awọn ibi-iṣan Ti farahan tẹlẹ lati jẹ apakan ti ọna HV1 Preton Watmetway ati lati ṣe bi All27,28. Awọn abajade wa nfihan pe awọn Ajọ Awoṣe ni awọn substanses meji jẹpọ ni ilu ti o wa ni ipin .Fide Lori ẹya gara ti gara ti awọn itọnisọna Hv1-Cipsp. (a) Stematic ti Hv1 VSD.based.based. Awọn ipo asọtẹlẹ ti dódé GBA ni a fihan bi oya dudu. Ni awọn atunto akọmọ meji meji bi a ti rii lati ẹgbẹ extracellular ti Plane Metane ti a ṣẹda nipasẹ S4 HALSDELELLETS 20 Awọn iwọn-ọrọ Nlacs si ọkọ ofurufu Member, pẹlu Iyatọ ti awọn opin ita ti awọn ọfa S4 meji (awọn ọfa ti o han), ṣe agbekalẹ iṣeto naa ni apa ọtun. Ninu iṣeto to somọ ti a rii ni eto imudani gara. Our results show that the repulsive electrostatic interaction between residue 123 (123D/123D or 123R/123R) is associated with a "normal" level of GBTA-binding cooperativity in the open state and shifts the interaction from repulsion to Attracted (123D/123R) , ifowosowopo pọ si (Fig. 5g). alaye ni pe pipa ipa ti gbigbe awọn iṣẹ inu hydrophilic ni ipa ti o ni iduroṣinṣin laarin iṣaro ti o ni oye, Abajade laipẹ pe Ipo D171 Ti ConA Guis Ci-Hv1 hv1 Ninu H123 ni H23 Ninu Ẹṣe Eniyan, Ti nṣe akiyesi pe D123 wa ni agbegbe h123 wa ni agbegbe hydrophilic ni ipinle ṣiṣi. Isunmọ ti awọn ikanni Hv1 ni a mọ lati ṣẹlẹ nipasẹ ọpọlọpọ awọn iyipada pupọ19,29,40,41,41.41.41.41,40,41.41.40 , atẹle nipasẹ gbigbe ipo iyatọ ti o fa awọn ere lati ṣi awọn iṣọkan ni ọna awọn atunto mejeeji, ati pe o rii pe iyipada keji-disluvely ni ipo D171. Iṣapẹẹrẹ ti ifihan fuluorisent wa ni ibamu pẹlu niwaju awọn ibaraenisọrọ Itanna laarin awọn ipoidojuko Iyipada. Iwe afọwọkọ elekitiro Ati medediates alosteric allosters bo laarin awọn aaye bbta mọlẹ. Fujiwawa et al25 dabaa pe wiwo tiẹta ti awọn ibi-ipamọ cytoplasmic ti o jo Gbogbo vsd ati onínọmbà ṣiṣe ti agbegbe ti o pọ si S4 Helix ati CCD.in awọn ikanni HVEMBane lati ṣii, ati awọn ikanni Crosslink waye labẹ awọn ipo nibiti ikanni ti ni agbara. Nitorinaa, awọn ayẹwo S4-S4 ti a ṣe afihan ti o tan imọlẹ iṣeto ti a rii ni ipinfunni fun ilowosi ti S1 ati S2 ninu Gatiju ti S1 ati S2 ninu awọn iṣọpọ iṣan ti o yatọ ni awọn ikanni subusanti ni ṣiṣi ati Awọn ipinlẹ pipade, imọran kan ni ibamu pẹlu awọn awari ti many et al. S1 gbe 39 lakoko titẹ. Nibi, a ṣafihan pe, ni ipo ti o ṣii, awọn opin extearsellular ti sunmọ to lati ṣe atilẹyin prosterict gidi ti o tẹpọ pẹlu awọn ajọṣepọ S4-S4 ti S4 ti o ga julọ. Yato si ara wọn lati ṣe ajọṣepọ taara. Knot 1 ° 20 šatona ti awọn iru-ọna ti o wa ni ayika aye ti ita ti awọn apa meta, fun iṣeto S1-SCE wa ni ibamu Pẹlu awọn awari wa (Figrt. 7B, Igbimọ Spress .We ṣeduro iṣeto ni fun ikanni ni Ipinle Ṣiṣi. Biotilẹjẹpe a ro pe The Halssiamu ti a ro lati ṣiṣẹ bi ọsan kan, igbesẹ ti o ya sọtọ ni apapọ. Fun Hv1 (Fig. 7C) .Nini diasters, ibugbe ti o sunmọ julọ, p140 ni S123 ni HV1 Ati awọn digesp ṣe imọran pe VSDs ti awọn ọlọjẹ wọnyi ni ifarahan-inu lati ṣe ni wiwo ohun ti awọn opin extracellular ti ajọṣepọ S1. Ipa pataki ti HV1 ni Ile-iṣẹ sẹẹli Sperm jẹ ki ikanni olomi ti o wuyi fun iṣakoso irọyin ti microglia ọkunrin iwalaaye ninu awọn alaisan pẹlu ọmu 12 tabi akàn akàn 13 ati pe a ronu lati ṣe alabapin si awọn ọran B-B-DERECEITS TI HV1 kekere Ṣii HV1 Charinit, ti o yori si ilopọ ti o mọ, o le ja si idagbasoke ti awọn oogun agbara diẹ sii fojusi awọn ikanni HV1. Awọn iṣẹ Mv1 ti a ṣe itọsọna ti eniyan Hv1 ti a ṣe ni lilo awọn imuposi Pc1nt.in The Hv1ncSp ṣe rọpo, awọn iṣẹ Hv1nt Asopọ C-parunt kan ni asopọ si N-Testinis ti Consuit keji.The PGSMasggsgsgsgsgsgsgsgsgsgsgsgsgsgsgsgng.The psatizs ti o ni akopọ Kit T7 MMMACHIN MMMAChing ohun elo (Ambion) .1-3 ọjọ ṣaaju awọn wiwọn itanna, CNG Lati inu ilodisi bioscerence.Fooforking kan, awọn sẹẹli ni a ṣetọju ni alabọde NCC6 mm bayi 2 . 2-Guididino-Bezimimadazole [1], 2-guigiazole [2], (4-methyl-1-yl) Guanidine [5] -Tiazol-2-yl) guanidine) [6] 5-Caryboxtate [9] CARIIDino-4-Methyl-5-methyl-5-YL) Acetate [10] O wa lati Sigra-Littl - (4-chlorophenyl) -1,3-thiazizol-2-yl] Guanidine [11- Ciazit-2-yl] Guanidiine- Lati Matrix.theses awọn iṣupọ jẹ ti mimọ ti o ga julọ. Wọn tu silẹ ni ojutu gbigbara 100 mi o kere ju 99% mimọ. Si idadoro ti 2-amino-4- (Triflurometl) Honzentithiol Hydrochloride (2.02 g, 4.5 mmol) ni a ṣafikun Doodindiamide (380 mG), ati abajade idapọmọra idapọpọ Ti yọ pẹlu agbara ti o dara fun wakati mẹrin 65 ° C) Fun awọn wakati pupọ, ati lẹhinna recrystallized lati ethyl acetate / Petherom lati fun ni toti funfun (500 miligila, 48%); MP 221-222 ° C (ina 225-226 ° C) 45; 1h NMR (500 mHz, DMSSO-d6): δ [PPM] = 7.25 (D, 1 HZ), 7.73 (D , 1 h, J = 8.1 HZ) .13c NMR (200 MHz, DMSSO-D6), D, 4.5 HZ), 124.7 (Q = 272 HZ), 126.1 (Q, J = 272 Hz), 132.1, 132.1, 178.5..GRMS : 261.0419. Navtho [1,2-D] Thiazol-2-aminz-2-aminzy 1.0 milimita ti bajẹ si awọn ege kekere ati fifọ pẹlu omi lati pese bia ofeefee amg kan to lagbara. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1h NMR (500 mHz, D2O-d6, D2O): δ [PPM] = 7.62 (T, 1.3 HZ), 7.77 (D, 1 h , J = 8.6 hz), 7.89 (D, 1 Dara), 8.62 (D, 1.3 Hz) .13c NMR (150 MHZ, DMSSO-D6): δ = 119.9, 122.7, 122.7, 122.7, 122.7, 122.7 12.7 , ri: 243.0704. Awọn iṣupọ Protents ni wọn ninu awọn abulẹ ti inu ati ita ti o n ṣalaye awọn iṣelọpọ oriṣiriṣi ) hannusulnic acid (MES), 30 mm tetraemymammamymammamymamymate, 5 mm, n'-teutacetic acid (fun apẹẹrẹ), tunṣe si PH 6.0 pẹlu awọn iwọn hyddroquide.all ni a ṣe ni 22 ± 2 ° C. ) ati ipilẹṣẹ8.1 (ipilẹṣẹ). Awọn ohun elo ti o ni awọn ifọkansi pupọ ti awọn ifasimu HV1 nibita ati ni awọn ọrọ mẹtta 10 mm aving si VCLVity Valva (ẹrọ ti o kọja lọ si VC-6. Awọn ami olukọni (Awọn ifihan agbara. +120 mpperamization awọn wiwọn pọ bi a ti gbasilẹ tẹlẹ18 lo lati ṣe atunṣe fun ibajẹ ti isiyi 18 Pẹlu idogba Hill: nibiti [i] nfọkansi ti inbiomcotters Emi ati h ni olutọju oke naa, idogba (2) jẹ atunto bi: