ખુલ્લી Hv1 પ્રોટોન ચેનલના ઇન્ટરસ્યુબ્યુનિટ ઇન્ટરફેસની પૂછપરછ એલોસ્ટેરીલી કમ્પલ્ડ પ્રોબ સાથે

Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે જે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો તેમાં CSS માટે મર્યાદિત સમર્થન છે. શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડ બંધ કરો). તે દરમિયાન, તેની ખાતરી કરવા માટે સતત સમર્થન, અમે શૈલીઓ અને જાવાસ્ક્રિપ્ટ વિના સાઇટ પ્રદર્શિત કરીશું. Hv1 વોલ્ટેજ-ગેટેડ પ્રોટોન ચેનલ એ બે વોલ્ટેજ-સેન્સિંગ ડોમેન્સ (VSDs) નો સમાવેશ કરતું ડાયમેરિક કોમ્પ્લેક્સ છે, જેમાંના પ્રત્યેકમાં ગેટેડ પ્રોટોન પરમીએશન પાથવે છે. ડાઇમરાઇઝેશન સાયટોપ્લાઝમિક કોઇલ્ડ-કોઇલ ડોમેન દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે. બંધ સ્થિતિમાંથી સંક્રમણ બંને VSDs માં ખુલ્લી સ્થિતિ સહકારી રીતે થાય છે તે જાણીતું છે; જો કે, અંતર્ગત મિકેનિઝમ્સ વિશે થોડું જાણીતું છે. ઇન્ટરસ્યુબ્યુનિટ ઇન્ટરફેસ એલોસ્ટેરિક પ્રક્રિયાઓમાં મુખ્ય ભૂમિકા ભજવે છે; જો કે, ઓપન Hv1 ચેનલોમાં આવા ઇન્ટરફેસની ઓળખ કરવામાં આવી નથી. અહીં અમે દર્શાવીએ છીએ કે 2-guanidinothiazole ડેરિવેટિવ્સ બે Hv1 VSDs ને સહકારી રીતે અવરોધિત કરે છે અને આ સંયોજનોમાંથી એકનો ઉપયોગ ખુલ્લા સબ્યુનિટ્સ વચ્ચે એલોસ્ટેરિક જોડાણ માટે ચકાસણી તરીકે કરે છે. અમને જાણવા મળ્યું કે એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર VSD ના પ્રથમ ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન ફ્રેગમેન્ટનો અંત એક ઇન્ટરસ્યુબ્યુનિટ ઇન્ટરફેસ બનાવે છે જે બંધનકર્તા સાઇટ્સ વચ્ચે જોડાણની મધ્યસ્થી કરે છે, જ્યારે કોઇલ-કોઇલ ડોમેન આ પ્રક્રિયામાં સીધી રીતે સામેલ નથી. અમને એ પણ મજબૂત પુરાવા મળ્યા છે કે ચેનલનું પ્રોટોન-પસંદગીયુક્ત ફિલ્ટર બ્લોકર-બંધનકર્તા સહકારને નિયંત્રિત કરે છે. . વોલ્ટેજ-ગેટેડ પ્રોટોન ચેનલો વિવિધ સજીવોમાં મહત્વની ભૂમિકા ભજવે છે, ફાયટોપ્લાંકટોનથી લઈને મનુષ્યો1. મોટા ભાગના કોષોમાં, આ ચેનલો પ્રોટોન મેમ્બ્રેનમાંથી પ્રોટોન પ્રવાહને મધ્યસ્થી કરે છે અને NADPH ઓક્સિડેઝની પ્રવૃત્તિને નિયંત્રિત કરે છે. મનુષ્યોમાં એકમાત્ર જાણીતી વોલ્ટેજ-ગેટેડ પ્રોટોન ચેનલ છે. Hv1 છે, જે HVCN1 જીન 2,3નું ઉત્પાદન છે. Hv1 (ઉર્ફે VSOP) એ B કોષના પ્રસારમાં ભૂમિકા ભજવતા દર્શાવવામાં આવ્યું છે, જન્મજાત રોગપ્રતિકારક તંત્ર દ્વારા પ્રતિક્રિયાશીલ ઓક્સિજન પ્રજાતિઓનું ઉત્પાદન5,6,7,8, શુક્રાણુ કોષ ગતિશીલતા9 અને વાયુમાર્ગની સપાટીના પ્રવાહીનું pH નિયમન10. આ ચેનલ બી-સેલ મેલીગ્નન્સી4,11 અને સ્તન અને કોલોરેક્ટલ કેન્સર 12,13 જેવા કેન્સરના પ્રકારોમાં વધુ પડતી અસરમાં સામેલ છે. વધુ પડતી Hv1 પ્રવૃત્તિ કેન્સરના કોષોની મેટાસ્ટેટિક સંભવિતતા 11, 12માં વધારો કરતી જોવા મળી હતી. મગજમાં, Hv1 વ્યક્ત થાય છે. માઇક્રોગ્લિયા દ્વારા, અને તેની પ્રવૃત્તિ ઇસ્કેમિક સ્ટ્રોકના મોડેલોમાં મગજના નુકસાનને વધારે છે તેવું દર્શાવવામાં આવ્યું છે. Hv1 પ્રોટીનમાં વોલ્ટેજ-સેન્સિંગ ડોમેન (VSD) હોય છે, જેમાં S1 થી S414 તરીકે ઓળખાતા ચાર ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન સેગમેન્ટ્સનો સમાવેશ થાય છે. VSD વોલ્ટેજ-ગેટેડ Na+, K+ અને Ca2+ ચેનલોના અનુરૂપ ડોમેન્સ અને સિવીએસપી જેવા વોલ્ટેજ-સંવેદનશીલ ફોસ્ફેટેસીસ જેવું લાગે છે. Ciona gutis15.આ અન્ય પ્રોટીનમાં, S4 નું C-ટર્મિનસ ઇફેક્ટર મોડ્યુલ, પોર ડોમેન અથવા એન્ઝાઇમ સાથે જોડાયેલ છે. Hv1 માં, S4 પટલની સાયટોપ્લાઝમિક બાજુ પર સ્થિત કોઇલ્ડ-કોઇલ ડોમેન (CCD) સાથે જોડાયેલ છે. .ચેનલ એક ડાયમેરિક કોમ્પ્લેક્સ છે જેમાં બે વીએસડીનો સમાવેશ થાય છે, જેમાં પ્રત્યેકમાં ગેટેડ પ્રોટોન પરિમેશન પાથવે છે 16,17,18. આ બે Hv1 સબ્યુનિટ્સ 19,20,21,22 સહકારી રીતે ખુલતા જોવા મળ્યા હતા, જે સૂચવે છે કે એલોસ્ટેરિક કપ્લીંગ અને આંતર-સબ્યુનિટ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ ચાલે છે. ગેટીંગ પ્રક્રિયામાં મહત્વની ભૂમિકા. કોઇલ કરેલ કોઇલ ડોમેનમાં સબયુનિટ્સ વચ્ચેનું ઇન્ટરફેસ સારી રીતે વ્યાખ્યાયિત થયેલ છે કારણ કે બે અલગ ડોમેન્સનું સ્ફટિક માળખું ઉપલબ્ધ છે22,23. બીજી તરફ, પટલની અંદર VSDs વચ્ચેનું ઇન્ટરફેસ નથી. સારી રીતે સમજી શકાય છે. Hv1-CiVSP ચાઇમેરિક પ્રોટીનનું સ્ફટિક માળખું આ ઇન્ટરફેસ વિશે માહિતી પ્રદાન કરતું નથી, કારણ કે સ્ફટિકીકૃત ચેનલ સંકુલની ટ્રિમેરિક સંસ્થા યીસ્ટ લ્યુસિન ઝિપર GCN424 દ્વારા મૂળ Hv1 CCDને બદલવાથી પરિણમી શકે છે. Hv1 ચેનલના સબ્યુનિટ સંસ્થાના તાજેતરના અભ્યાસમાં તારણ આવ્યું છે કે બે S4 હેલિકો સેકન્ડરી સ્ટ્રક્ચરના ગંભીર વિક્ષેપ વિના CCDમાં સંક્રમણ કરે છે, પરિણામે લાંબી હેલિકોસ જે પટલમાંથી શરૂ થાય છે અને સાયટોપ્લાઝમમાં પ્રોજેક્ટ કરે છે. સિસ્ટીન ક્રોસલિંકિંગ વિશ્લેષણના આધારે, આ અભ્યાસ સૂચવે છે કે Hv1 VSDs S4 સેગમેન્ટમાં એકબીજાનો સંપર્ક કરે છે. જો કે, અન્ય અભ્યાસોએ VSDs વચ્ચે વૈકલ્પિક ઈન્ટરફેસનો પ્રસ્તાવ મૂક્યો છે. આ ઈન્ટરફેસમાં S1 સેગમેન્ટ 17, 21, 26 અને S2 સેગમેન્ટ 21 ના ​​બાહ્ય છેડાનો સમાવેશ થાય છે. વિરોધાભાસનું સંભવિત કારણ આ અભ્યાસોના પરિણામો એ છે કે ગેટીંગ પ્રક્રિયાના સંબંધમાં VSDs વચ્ચેના એલોસ્ટેરિક જોડાણની તપાસ કરવામાં આવી હતી, જે બંધ અને ખુલ્લી સ્થિતિઓ પર આધાર રાખે છે, અને VSDs વચ્ચેનું ઇન્ટરફેસ અલગ-અલગ સ્થિતિમાં બદલાવમાં બદલાઈ શકે છે. અહીં, અમને જાણવા મળ્યું કે 2-ગુઆનિડિનોથિયાઝોલ Hv1 ચેનલોને બે ખુલ્લા VSDs સાથે સિનર્જિસ્ટિક રીતે બંધનકર્તા કરીને અટકાવે છે, અને ઓપન સ્ટેટમાં સબ્યુનિટ્સ વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની તપાસ કરવા માટે સંયોજનોમાંથી એક, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA) નો ઉપયોગ કર્યો છે. ઇન્ટરફેસ.અમે જોયું કે GBTA બંધનકર્તા વળાંકને માત્રાત્મક મોડેલ દ્વારા સારી રીતે વર્ણવી શકાય છે જેમાં અવરોધકને એક સબ્યુનિટ સાથે જોડવાથી અડીને આવેલા સબ્યુનિટની બંધનકર્તા જોડાણમાં વધારો થાય છે. અમને એ પણ જાણવા મળ્યું કે અવશેષો D112, પસંદગીના ફિલ્ટર્સ ચેનલ 27, 28 અને ગ્વાનિડિન ડેરિવેટિવ બાઈન્ડિંગ સાઈટનો ભાગ 29 GBTA બાઈન્ડિંગ કોઓપરેટિવિટીને નિયંત્રિત કરે છે. અમે બતાવીએ છીએ કે Hv1 ડિમરમાં કોઓપરેટિવ બાઈન્ડિંગ જાળવવામાં આવે છે, જ્યાં CCD S4 સેગમેન્ટથી અલગ પડે છે, જે સૂચવે છે કે CCDમાં ઈન્ટરસબ્યુનિટ ઈન્ટરફેસ સીધું નથી. GBTA-બંધનકર્તા સાઇટ્સ વચ્ચે એલોસ્ટેરિક જોડાણની મધ્યસ્થી કરો. તેનાથી વિપરિત, અમે શોધીએ છીએ કે S1 ટુકડો સબ્યુનિટ્સ વચ્ચેના ઇન્ટરફેસનો ભાગ છે અને પરવાનગી આપવા માટે S4 હેલિક્સના એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર છેડા સાથે સંલગ્ન VSDs ની ગોઠવણીનો પ્રસ્તાવ મૂકે છે. S1 ટુકડો ખુલ્લી સ્થિતિમાં હોવો જોઈએ. Hv1 ના નાના પરમાણુ અવરોધકો કેન્સર વિરોધી દવાઓ અને ન્યુરોપ્રોટેક્ટીવ એજન્ટો તરીકે ઉપયોગી છે. જો કે, આજની તારીખમાં, થોડા સંયોજનો ચેનલ 30,31,32,33 ને અટકાવવામાં સક્ષમ છે. તેમાંથી, 2-ગુઆનીડિનોબેન્ઝિમિડાઝોલ (2GBI, સંયોજન [1] ફિગમાં છે. 1a) અને તેના ડેરિવેટિવ્ઝ ચેનલ દ્વારા પ્રોટોનના VSD29,32 પ્રવેશને અવરોધે છે. આવા સંયોજનોનું બંધન બે ખુલ્લા સબ્યુનિટ્સમાં સ્વતંત્ર રીતે થાય છે તેવું માનવામાં આવે છે. 2-guanidinobenzothiazole (GBTA, સંયોજન [2] આકૃતિ 1a માં) અગાઉ 200 μM (આકૃતિ 1b) ની સાંદ્રતા પર પરીક્ષણ કરવામાં આવે ત્યારે લગભગ 2GBI જેટલું અસરકારક રીતે Hv1 ને અટકાવતું બતાવવામાં આવ્યું હતું. અમે અન્ય થિયાઝોલ ડેરિવેટિવ્ઝની તપાસ કરી અને જાણવા મળ્યું કે તેમાંના કેટલાક GBTA (આકૃતિ 1 અને પૂરક) કરતા સમાન અથવા વધુ શક્તિ સાથે ચેનલને અવરોધે છે. ટેક્સ્ટ).અમે ચાર થિઆઝોલ ડેરિવેટિવ્ઝ (GBTA અને સંયોજનો [3], [6] અને [11], ફિગ. 1c) ના સાંદ્રતા પ્રતિભાવ વળાંક નક્કી કર્યા અને જાણવા મળ્યું કે તેઓ 2GBI કરતા વધારે છે. હિલ ગુણાંક (h) થિઆઝોલ ડેરિવેટિવ્ઝની રેન્જ 1.109 ± 0.040 થી 1.306 ± 0.033 (ફિગ. 1c અને પૂરક ફિગ. 1). તેનાથી વિપરિત, 2GBI માટે હિલ ગુણાંક 0.975 ± 0.024 29, ફિગ. 2a અને પૂરક ફિગ. 1 હતો. 1 ઉપરનો હિલ ગુણાંક બંધનકર્તા સહકાર દર્શાવે છે. કારણ કે પ્રત્યેકની પોતાની Hv1-અન્યબિટમાં તેની પોતાની છે. બંધનકર્તા સાઇટ,29,32 અમે તર્ક આપ્યો હતો કે થિઆઝોલ ડેરિવેટિવને એક સબ્યુનિટ સાથે જોડવાથી નજીકના સબ્યુનિટ સાથે બીજા અવરોધક પરમાણુના બંધનને વધારી શકે છે. GBTA એ ઉચ્ચતમ હિલ ગુણાંક સાથેનું પરીક્ષણ સંયોજન હતું. તેથી, અમે આ સંયોજન પસંદ કર્યું બાઈન્ડિંગ સિનર્જીની પદ્ધતિનો વધુ અભ્યાસ કર્યો અને સંદર્ભ નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે 2GBI નો ઉપયોગ કર્યો. (a) પરીક્ષણ સંયોજનો: [1] સંદર્ભ Hv1 અવરોધક 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-ગુઆનીડીનો-બેન્ઝોથિયાઝોલ (GBTA), [3] (5-ટ્રાઇફ્લોરોમેથાઈલ-1,3-બેન્ઝોથિયાઝોલ-2-yl)ગુઆનીડીન, [4] નેપ્થો[1,2-d][1, 3] થિયાઝોલ-2-yl -ગુઆનીડીન, [5](4-મિથાઈલ-1,3-થિયાઝોલ-2-yl)ગુઆનીડીન, [6](5-બ્રોમો-4-મિથાઈલ-1,3-થિયાઝોલ-2-yl)ગુઆનીડીન, [7] ફેમોટીડીન, [8] 2-ગુઆનીડીનો-5-મિથાઈલ-1,3-થિયાઝોલ-4-કાર્બોક્સિલિક એસિડ એથિલ એસ્ટર, [9] 2-ગુઆનીડીનો-4-મિથાઈલ ઇથિલ-1,3-થિયાઝોલ-5-કાર્બોક્સિલેટ, [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ઇથિલ એસિટેટ, [11]1-[4-(4 -ક્લોરોફેનાઇલ)-1,3-થિયાઝોલ-2-yl]ગુઆનીડીન, [ 12]1-[4-(3,4-ડાઇમેથોક્સીફેનાઇલ)-1,3-થિયાઝોલ-2-yl]ગુઆનીડીન .(b) સૂચવેલ ગુઆનિડિનોથિયાઝોલ્સ અને સંદર્ભ સંયોજન 2GBI (વાદળી-લીલા બાર) દ્વારા માનવ Hv1 પ્રવૃત્તિનું નિષેધ. .Hv1 પ્રોટોન પ્રવાહો -80 mV થી +120 mV ના હોલ્ડિંગ સંભવિત વિધ્રુવીકરણના પ્રતિભાવમાં Xenopus oocytes ની અંદરથી બહારની તકતીઓમાં માપવામાં આવ્યા હતા. દરેક અવરોધકને 200 μM.pHi = pHo = 6.0 ની સાંદ્રતામાં સ્નાનમાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. .ડેટા સરેરાશ ±SEM (n≥4) છે.(c) સંયોજનો [2], [3], [6] અને [11] દ્વારા માનવ Hv1 નું એકાગ્રતા-આધારિત અવરોધ.દરેક બિંદુ સરેરાશ અવરોધ ± SD 3નું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. 15 માપ સુધી. લાઇન એ હિલ ફિટ છે જેનો ઉપયોગ પૂરક કોષ્ટક 1 માં નોંધાયેલા દેખીતા Kd મૂલ્યો મેળવવા માટે થાય છે. હિલ ગુણાંક પૂરક આકૃતિ 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (પદ્ધતિઓ જુઓ). (a,b) સંયોજનો 2GBI અને GBTA એ એકાગ્રતા-આધારિત રીતે dimeric અને monomeric Hv1 ને અવરોધે છે. દરેક બિંદુ 3 થી 8 માપના સરેરાશ નિષેધ ± SD દર્શાવે છે અને વળાંક હિલ ફિટ છે. હિલ ગુણાંક (h) માં દર્શાવેલ છે. ઇન્સેટ હિસ્ટોગ્રામ પૂરક ફિગ 3 અને 4 માં નોંધાયેલા ફીટ્સ પરથી નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા. (a) માં દર્શાવેલ GBTA ની સાંદ્રતા પ્રતિભાવ ફિગ 1c માં દર્શાવેલ સમાન છે. દેખીતી Kd મૂલ્યો માટે પૂરક કોષ્ટક 1 જુઓ. (c) નું મોડેલિંગ GBTA નું dimeric Hv1 સાથેનું સહકારી બંધન. ઘન કાળી રેખા સમીકરણ (6) દ્વારા પ્રાયોગિક ડેટામાં ફિટને રજૂ કરે છે, જે (d) માં દર્શાવેલ બંધનકર્તા મોડેલનું વર્ણન કરે છે. સબ 1 અને સબ 2 લેબલવાળી ડેશવાળી રેખાઓ બાયમોલેક્યુલર એસોસિએશનનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. - અનુક્રમે પ્રથમ અને બીજી બંધનકર્તા ઘટનાઓના વિયોજન સંતુલન વક્ર (સબ 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; સબ 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Hv1 બ્લોકની સૂચિત મિકેનિઝમની યોજનાકીય રેખાકૃતિ. GBTA ના કિસ્સામાં, એક ઓપન સબ્યુનિટ સાથે બંધન એ અડીને આવેલા ઓપન સબ્યુનિટ (Kd2 0.05, Fig. 5d) ની તુલનામાં કોઈપણ અવરોધકના હિલ ગુણાંકમાં નોંધપાત્ર ફેરફાર કર્યો નથી. ). બીજી બાજુ, પરિવર્તન D123A એ GBTA (p 0.05/14). બંને સબયુનિટ્સ પર પોઝિશન 123 પર ચાર્જને તટસ્થ કરવાથી GBTA બંધનકર્તા સહકારમાં મજબૂત ફેરફાર થયો હતો, જ્યારે બંને સબ્યુનિટ્સ પર ચાર્જને ઉલટાવી દેવાની માત્ર થોડી અસર હતી, અમે ચાર્જની વ્યુત્ક્રમ ચેનલ સાથે માત્ર એક સબ્યુનિટને સમાવવા માટે વિશ્લેષણને વિસ્તૃત કર્યું છે. C-ટર્મિનલ સબ્યુનિટ (ફિગ. 5b) માં D123R અવેજી સાથે Hv1-લિંક્ડ ડાયમર્સ જનરેટ કર્યા અને GBTA અને 2GBI દ્વારા સાંદ્રતા-પ્રતિભાવ અવરોધને માપ્યો. અમને જાણવા મળ્યું કે GBTA નું હિલ ગુણાંક WT-D123R ચેનલો કરતાં નોંધપાત્ર રીતે વધારે હતું. વાઇલ્ડ-ટાઇપ Hv1 (p 0.05). અમે એ પણ શોધી કાઢ્યું છે કે βME ની ગેરહાજરીમાં, D112E I127C Hv1 ડાઇમર સાથે બંધનકર્તા GBTA નો હિલ ગુણાંક ઘટાડતા એજન્ટો (ફિગ. 6e અને પૂરક ફિગ. 4) ની હાજરીમાં માપવામાં આવેલા તેના કરતા નોંધપાત્ર રીતે વધારે હતો, જે સૂચવે છે કે D112E પરિવર્તન સિસ્ટીન 127 ના ક્રોસ-લિંકિંગના પરિણામે જીબીટીએ બંધનકર્તા સહકારમાં થયેલા વધારાને નાબૂદ કર્યો નથી. D112E, I127C Hv1 ડાઇમર્સ સાથે 2GBI બંધનકર્તાનો હિલ ગુણાંક પણ D112E પરિવર્તન (આકૃતિ 1).6d અને પૂરક દ્વારા નોંધપાત્ર રીતે પ્રભાવિત થયો ન હતો. ફિગ. 3). એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ તારણો સૂચવે છે કે આકર્ષક ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા નજીકના Hv1 સબ્યુનિટ્સમાં S1 ટુકડાઓના બાહ્ય છેડાઓ વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા અથવા સ્થાનો વચ્ચે અવેજીકૃત સિસ્ટીન એલોસ્ટેરિક જોડાણની રચના દ્વારા GBTA બંધનકર્તા વધે છે અને બંધનકર્તા સહકારમાં પરિણમે છે. જ્યારે સહકારીતા પર આકર્ષક ઈલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની અસર પરિવર્તન D112E દ્વારા નાબૂદ કરી શકાય છે, સહસંયોજક બોન્ડની અસર થઈ શકતી નથી. ગ્વાનિડિન ડેરિવેટિવ્ઝને Hv1 ચેનલો સાથે જોડવા માટે ઉપલબ્ધ રાસાયણિક જગ્યાના અમારા અન્વેષણમાં, અમને જાણવા મળ્યું કે GBTA જેવા 2-guanidinothiazoles 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c) કરતાં વધુ એકાગ્રતા અવલંબન ધરાવે છે .જીબીટીએ બંને ડાયબિનીકના હિલ ગુણાંકનું વિશ્લેષણ. અને મોનોમેરિક ચેનલો (ફિગ. 2a,b) અને ડાઇમરિક ચેનલ કે જેમાં એક સબયુનિટ અવરોધક (ફિગ. 4) સાથે પૂર્વ-બંધાયેલું હતું તે અમને નિષ્કર્ષ પર દોરી જાય છે કે GBTA દ્વારા Hv1 નું નિષેધ ક્રિયા એક સિનર્જિસ્ટિક પ્રક્રિયા છે, અને બે સબ્યુનિટ્સમાં સંયોજનોની બંધનકર્તા સાઇટ્સ એલોસ્ટેરીલી રીતે જોડાયેલી છે. GBTA ખુલ્લી ચેનલ સાથે જોડાય છે તે શોધ, જે અગાઉ સંબંધિત સંયોજન 2GBI32 માટે બતાવેલ છે, તે સૂચવે છે કે એલોસ્ટેરિક કપ્લિંગનું મૂલ્યાંકન ખાસ કરીને ઓપન સ્ટેટમાં કરી શકાય છે. અમારું સહકારી બંધનકર્તા મોડેલ જીબીટીએ (ફિગ. 2 સી) દ્વારા એચવી 1 ના નિષેધને માત્રાત્મક રીતે વર્ણવવા અને પટલ રિપ્લેરાઇઝેશન પછી ચેનલ પૂંછડીના પ્રવાહોના સડો પર 2 જીબીઆઈ અને જીબીટીએના વિવિધ પ્રભાવોને સમજાવવા માટે સક્ષમ હતું, જે બંધનકર્તા પ્રક્રિયાના અમારા અર્થઘટનને સમર્થન આપે છે. મહત્તમ ટેકરી ગુણાંક કે જે બે બંધનકર્તા સાઇટ્સ (જેમ કે એચવી 1) સાથે એલોસ્ટેરિક પ્રોટીનમાં પ્રાપ્ત કરી શકાય છે. 1.31 ના ગુણાંક સાથે એચવી 1 વાઇલ્ડ-ટાઇપને બાંધવા માટે જીબીટીએ માપવા માટે, એચવી 1 આઇ 127 સીમાં 1.88 થઈ ગયું છે. સિનર્જીસ્ટિક મુક્ત energy ર્જા, એચવી 1 વાઇલ્ડ-ટાઇપના કિસ્સામાં સૌથી નીચી અને ઉચ્ચતમ જોડાણ સાઇટ્સ (પદ્ધતિઓ જુઓ) ની બંધનકર્તા મુક્ત શક્તિઓ (પદ્ધતિઓ જુઓ) વચ્ચેનો તફાવત એચવી 1 આઇ 127 સીના કિસ્સામાં 1.3 કેસીએલ/છછુંદર હતો. બંધનકર્તા ઓક્સિજનથી હિમોગ્લોબિન એ સહયોગી પ્રક્રિયા 38 નું સૌથી પ્રખ્યાત અને સારી રીતે અભ્યાસ કરેલું ઉદાહરણ છે. માનવ હિમોગ્લોબિન (ચાર એલોસ્ટેરિકલી જોડી બંધનકર્તા સાઇટ્સ સાથેનો ટેટ્રેમર), 1.26 થી 3.64 સુધીના મૂલ્યો સાથે, 2.5-3.0 થી ટેકરી ગુણાંક રેન્જ છે કેસીએએલ/મોલ, પ્રાયોગિક પરિસ્થિતિઓ પર આધાર રાખીને. 38. થી, વૈશ્વિક get ર્જાસભરની દ્રષ્ટિએ, એચવી 1 ને બંધનકર્તા જીબીટીએની સહકારીતા હિમોગ્લોબિનને બંધનકર્તા કરતા નોંધપાત્ર રીતે અલગ નથી, જ્યારે બે સિસ્ટમોમાં વિવિધ સંખ્યામાં પ્રોટીન સબ્યુનિટ્સની સંખ્યા ધ્યાનમાં લેવામાં આવે છે. અમારા સિનર્જી મોડેલમાં, જીબીટીએ પરમાણુઓને એક સબ્યુનિટ સાથે બંધનકર્તા, અડીને આવેલા સબ્યુનિટના બંધનકર્તા જોડાણમાં વધારો થાય છે. અમે એક પ્રક્રિયાની કલ્પના કરીએ છીએ જેમાં પ્રથમ બંધનકર્તા ઇવેન્ટ (પ્રેરિત ફિટ) ના પરિણામે બંધનકર્તા વાતાવરણની ફરીથી ગોઠવણી તરફ દોરી જાય છે સબ્યુનિટ્સ વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયામાં ફેરફાર. આ ફેરફારોનો પ્રતિસાદ, અડીને આવેલા સબ્યુનિટ્સ તેમની બંધનકર્તા સાઇટ્સને બદલી નાખે છે, પરિણામે સખત જીબીટીએ બંધનકર્તા. આ પ્રક્રિયાને ધ્યાનમાં રાખીને, એસ 1 એસ્પાર્ટેટ ડી 112 વધતા બંધનકર્તા જોડાણ સાથે સંકળાયેલ બંધનકર્તા સાઇટની ફરીથી ગોઠવણી માટે જવાબદાર છે. ડી 112 અગાઉ એચવી 1 પ્રોટોન પર્મેશન પાથવેનો ભાગ બન્યો હતો અને પસંદગીના ફિલ્ટર 27,28 તરીકે કાર્યરત હતું. અમારા પરિણામો બતાવે છે કે બે એચવી 1 સબ્યુનિટ્સમાં પસંદગીના ફિલ્ટર્સ ખુલ્લા રાજ્યમાં જોડાયેલા છે. ફિગ્યુર 7 એ જીબીટીએ બંધનકર્તા સાઇટનું આશરે સ્થાન અને એચવી 1 વીએસડી આધારિત આધારિત અવશેષો ડી 112, ડી 123, કે 125 અને આઇ 127 નું સ્થાન બતાવે છે એચવી 1-સીઆઈવીએસપી ચિમેરાની ક્રિસ્ટલ સ્ટ્રક્ચર પર. એસ 1 ના એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર અંત સાથે સંકળાયેલ એલોસ્ટેરિક કપ્લિંગ માટે સુગસ્ટેડ દિશાઓ કાળા તીર સાથે બતાવવામાં આવી છે. (એ) એચવી 1 વીએસડીની યોજનાકીય, એચવી 1-સીઆઈવીએસપી ચિમેરાના ક્રિસ્ટલ સ્ટ્રક્ચર પર આધારિત, હેલિકલ સેગમેન્ટ્સ સિલિન્ડ્રિકલ હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું છે. આ ગોઠવણીમાં, એસ 4 સેગમેન્ટનો આંતરિક અંત સીસીડી સાથે મર્જ કરે છે (બતાવેલ નથી). બાઉન્ડ જીબીટીએના અનુમાનિત સ્થાનોને ગ્રે અંડાશય તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યા છે. બ્લેક તીર બે અડીને આવેલા સબ્યુનિટ્સમાં બંધનકર્તા સાઇટ્સ વચ્ચે એલોસ્ટેરિક કપ્લિંગમાં સામેલ માર્ગો સૂચવે છે. તપાસ કરેલ એસ 1 અવશેષોની સ્થિતિ રંગીન ગોળાઓ સાથે ચિહ્નિત થયેલ છે. (બી) એચવી 1 સબ્યુનિટ્સનું યોજનાકીય ઉદાહરણ પટલ વિમાનની એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર બાજુથી જોવા મળ્યા મુજબ બે અલગ અલગ ડાયમર રૂપરેખાંકનોમાં. ડાબી પેનલ પર, ડાયમર ઇન્ટરફેસ એસ 4 હેલિક્સ દ્વારા રચાય છે. બે વીએસડી 20 ડિગ્રી ઘડિયાળની આજુબાજુના પટલના વિમાનના કાટખૂણેની આસપાસ ઘડિયાળની દિશામાં રચાય છે. બે એસ 4 હેલિક્સ (ડેશેડ એરો) ના બાહ્ય છેડાને અલગ કરવા, જમણી બાજુએ બતાવેલ ગોઠવણી ઉત્પન્ન કરે છે. આ રૂપરેખાંકનમાં, અવશેષો ડી 123 અને આઇ 127 ને નજીકના સબ્યુનિટ્સથી એક સાથે આવવાની મંજૂરી છે. (સી) સીઆઇવીએસપી વીએસડીનું યોજનાકીય રજૂઆત 4 જી 80 ક્રિસ્ટલ સ્ટ્રક્ચરમાં મળેલા ડાયમર ગોઠવણીમાં. સીઆઈવીએસપીમાં પી 140 એચવી 1 માં ડી 123 ની સ્થિતિને અનુરૂપ છે. અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે અવશેષો 123 (123 ડી/123 ડી અથવા 123 આર/123 આર) વચ્ચેના વિકરાળ ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયા ખુલ્લા રાજ્યમાં જીબીટીએ-બંધનકર્તા સહકારીતાના "સામાન્ય" સ્તર સાથે સંકળાયેલ છે અને ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને આકર્ષિત તરફ આકર્ષિત કરે છે (123 ડી/123 આર) , સહકાર વધ્યો (ફિગ. 5 જી) સમજૂતી એ છે કે હાઇડ્રોફિલિક વાતાવરણમાં હાઇડ્રોફોબિક અવશેષો મૂકવાની અસ્થિર અસર, ડી 123 અવશેષો વચ્ચેના વિકરાળ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને દૂર કરવાને કારણે સ્થિર અસરને વટાવી શકે છે. સિઓના ગુટિસ સીઆઈ-એચવી 1 ની સ્થિતિ ડી 171 (માનવ એચવી 1 માં ડી 123 ને અનુરૂપ) સક્રિયકરણ પર વધી છે, તે કલ્પનાને સમર્થન આપે છે કે ડી 123 ખુલ્લા રાજ્યમાં હાઇડ્રોફિલિક વાતાવરણમાં સ્થિત છે. એચવી 1 ચેનલોનું ગેટિંગ બહુવિધ સંક્રમણો 19,20,26,39,40,41 દ્વારા થાય છે. , એક અલગ સંક્રમણ પછી, જે બંને સબ્યુનિટ્સ પાથમાં પ્રોટોનને ખોલવાનું કારણ બને છે. વોલ્ટેજ સેન્સરના કન્ફર્મેશનલ પરિવર્તનનું વોલ્ટેજ-ક્લેમ્પ ફ્લોરોસન્સ દ્વારા નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું, અને એવું જાણવા મળ્યું છે કે ડી 171 પોઝિશન પર પરિવર્તન દ્વારા બીજો સંક્રમણ પસંદગીયુક્ત રીતે ખળભળાટ મચી ગયો હતો. ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલની પરેશાન, કન્ફર્મેશનલ પરિવર્તનના પ્રતિક્રિયા સંકલન સાથે કેટલાક તબક્કે અડીને સબ્યુનિટ્સના ડી 171 અવશેષો વચ્ચે ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની હાજરી સાથે સુસંગત છે. આ અર્થઘટન અમારી શોધ સાથે સુસંગત છે કે ડી 1223 અવશેષો ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિકલી ખુલ્લી સ્થિતિમાં ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે. અને જીબીટીએ બંધનકર્તા સાઇટ્સ વચ્ચે એલોસ્ટેરિક યુગની મધ્યસ્થતા કરે છે. ફુજીવારા એટ અલ 25 એ પ્રસ્તાવ મૂક્યો કે સાયટોપ્લાઝમિક કોઇલ-કોઇલ ડોમેનનો ડાયમર ઇન્ટરફેસ પટલમાં વિસ્તરે છે જેમાં બે એસ 4 હેલિક્સ (ફિગ. 7 બી, ડાબી પેનલ) સમાવિષ્ટ છે. આ ઇંટરબ્યુનિટ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાનું એક મોડેલ સિસ્ટીન ક્રોસ-લિંકિંગ વિશ્લેષણ પર આધારિત છે. એસ 4 હેલિક્સ અને સીસીડી.ને જોડતા પ્રદેશના સંપૂર્ણ વીએસડી અને કાર્યાત્મક વિશ્લેષણ. ટ્રાંસમેમ્બ્રેન પીએચ grad ાળની ગેરહાજરીમાં, એચવી 1 ચેનલોને ખોલવા માટે નોંધપાત્ર પટલ ડિપોલેરાઇઝેશનની જરૂર પડે છે, અને સિસ્ટેઇન ક્રોસલિંકિંગ એવી પરિસ્થિતિમાં થાય છે જ્યાં ચેનલ મુખ્યત્વે બંધ છે. તેથી, શોધાયેલ એસ 4-એસ 4 ઇન્ટરફેસ સંભવિત sub ફ-સ્ટેટ સબ્યુનિટ ગોઠવણીને પ્રતિબિંબિત કરે છે. અન્ય અભ્યાસોને ગેટિંગ 17,21,26 દરમિયાન ઇન્ટરસ્યુબ્યુનિટ ક્રિયાપ્રતિક્રિયામાં એસ 1 અને એસ 2 ની સંડોવણી માટેના પુરાવા મળ્યાં છે જે સૂચવે છે કે ચેનલો ખુલ્લામાં વિવિધ સબ્યુનિટ ગોઠવણીઓ અપનાવી શકે છે અને બંધ રાજ્યો, મોની એટ અલના તારણો સાથે સુસંગત એક વિચાર. ગેટિંગ દરમિયાન એસ 1 39 ફરે છે. અહીં, અમે બતાવીએ છીએ કે, ખુલ્લી સ્થિતિમાં, એસ 1 હેલિક્સના એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર છેડા સીધા ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને ટેકો આપવા માટે પૂરતા નજીક છે જે સબ્યુનિટ્સ વચ્ચે એલોસ્ટેરિક યુગની મધ્યસ્થતા કરે છે. વિસ્તૃત એસ 4-એસ 4 ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ સાથે ડાયમર ગોઠવણીમાં, એસ 1 હેલિકોસ ખૂબ દૂર છે એકબીજા સિવાય સીધા સંપર્ક કરવા માટે. તેમ છતાં, બે એસ 4 હેલિક્સના બાહ્ય છેડાને અલગ કરવા સાથે, એક એસ 1-એસ 1 રૂપરેખાંકન સાથે જોડાયેલા, પટલ વિમાનના કાટખૂણે અક્ષની આસપાસ બે વીએસડી સબ્યુનિટ્સનું 20 ° ઘડિયાળની દિશામાં પરિભ્રમણ અમારા તારણો સાથે (ફિગ. 7 બી, જમણી પેનલ) .અમે ખુલ્લા રાજ્યમાં ચેનલ માટે આ ગોઠવણીની ભલામણ કરીએ છીએ. તેમ છતાં સીઆઈવીએસપી એન્ઝાઇમ મોનોમર તરીકે કાર્ય કરે છે, તેમ છતાં, તેના અલગ વીએસડીની સ્ફટિક રચના એક ડાયમર રાજ્યમાં કબજે કરવામાં આવી છે. આ ડાયમરમાં એસ 1 હેલિકિસના બાહ્ય છેડા અવકાશી રીતે એકસાથે નજીક છે, અને એકંદર રૂપરેખાંકન તે સૂચિત સમાન છે એચવી 1 (ફિગ. 7 સી) માટે .આ સીઆઇવીએસપી ડાયમરમાં, નજીકના સબ્યુનિટમાંથી નજીકનો અવશેષો પોઝિશન 140 (ફિગ. 7 સી) પર પ્રોલેઇન હતો .આ સિવએસપીમાં પી 140 એચવી 1 માં ડી 123 ની સ્થિતિને અનુરૂપ છે. એચવી 1 વચ્ચે સબ્યુનિટ ગોઠવણીમાં સમાનતા અને સીઆઈવીએસપી ડાયમર સૂચવે છે કે આ પ્રોટીનના વીએસડીમાં ઇન્ટરફેસ બનાવવાની આંતરિક વૃત્તિ હોય છે જ્યાં એસ 1 ના એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર અંત સંપર્ક કરે છે. શુક્રાણુ સેલ સક્રિયકરણમાં એચવી 1 ની આવશ્યક ભૂમિકા આ ​​ચેનલને પુરુષ પ્રજનનક્ષમતાના નિયંત્રણ માટે એક આકર્ષક ડ્રગ લક્ષ્ય બનાવે છે. ફર્થરમોર, માઇક્રોક્લિયામાં એચવી 1 નું સક્રિયકરણ ઇસ્કેમિક સ્ટ્રોકથી પુન recovery પ્રાપ્તિને વધુ ખરાબ કરતું બતાવવામાં આવ્યું છે. એન્હન્સ્ડ એચવી 1 પ્રવૃત્તિ નીચલા સાથે સંકળાયેલ હોવાનું જાણવા મળ્યું છે. સ્તન 12 અથવા કોલોરેક્ટલ કેન્સર 13 ના દર્દીઓમાં અસ્તિત્વ અને બી-સેલની દૂષિતતામાં ફાળો આપવાનું માનવામાં આવે છે. 11. પછી, એચવી 1 ને લક્ષ્યાંકિત કરતી નાની પરમાણુ દવાઓ ન્યુરોપ્રોટેક્ટીવ એજન્ટો અથવા એન્ટીકેન્સર ઉપચાર તરીકે ઉપયોગ કરી શકાય છે. આ શોધ કે ગ્વાનિડિનોથિઆઝોલ ડેરિવેટિવ્ઝ કન્ફ્રિપ્શનલ રીઅરજમેન્ટ્સને પ્રેરિત કરી શકે છે. ઓપન એચવી 1 સબ્યુનિટ, જે બંધનકર્તા લગાવ તરફ દોરી જાય છે, તે એચવી 1 ચેનલોને લક્ષ્યાંકિત કરતી વધુ શક્તિશાળી દવાઓના વિકાસ તરફ દોરી શકે છે. માનવીય એચવી 1 ના સાઇટ-નિર્દેશિત મ્યુટેજેનેસિસ પ્રમાણભૂત પીસીઆર તકનીકોનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. એચવી 1 એનસીસીઆઈવીએસપી કન્સ્ટ્રક્શનમાં, એચવી 1 ના અવશેષો 1-96 અને 228-273 ને અવશેષો 1-113 અને 240-576 દ્વારા બદલી કરવામાં આવી હતી. એચવી 1-લિંક્ડ ડાયમર, એક સબ્યુનિટનો સી-ટર્મિનસ જીજીએસજીએસજીએસજીએસજીએસજીજીજીએસજીજી લિન્કર દ્વારા બીજા સબ્યુનિટના એન-ટર્મિનસ સાથે જોડાયેલો છે. વિવિધ બાંધકામો ધરાવતા પીજીઇએમએચઇ પ્લાઝમિડ્સ એનએચઇ 1 અથવા એસપીએચ 1 પ્રતિબંધ એન્ઝાઇમ્સ (ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સ) સાથે રેખીય કરવામાં આવ્યા હતા અને આરએનએ સિનેંસીસ સાથે કરવામાં આવ્યા હતા. ટી 7 મેમેસેજ એમમાચિન ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન કીટ (એમ્બિયન) .1-3 દિવસ પહેલાં ઇલેક્ટ્રોફિઝિયોલોજિકલ માપન પહેલાં, સીઆરએનએ ઝેનોપસ oc ઓસાઇટ્સ (સેલ દીઠ 50 એનએલ, 0.3-1.5 μg/μl) માં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું. ઝેનોપસ લેવિસ (નાસ્કો) માંથી ઝેનોપસ લેવિસમાંથી સ્ટેજ વી અને વી ઓઓસાઇટ્સ ઇકોસાઇટ બાયોસાયન્સથી આર.એન. . 2-ગુનીડિનો-બેન્ઝિમિડાઝોલ [1], 2-ગુનીડિનો-બેન્ઝોથિઆઝોલ [2], (4-મિથાઈલ-1,3-થિયાઝોલ -2-યિલ) ગ્યુનિડિન [5], (5-બ્રોમો -4-મેથિલ -1,3 -થિયાઝોલ -2-યિલ) ગુઆનીડાઇન) []], ઇથિલ 2-ગુનીડિનો -5-મેથિલ-1,3-થિયાઝોલ-4-કાર્બોક્સિલેટ []], ઇથિલ 2-ગુઆનિડિનો -4- મિથાઈલ-1,3-થિયાઝોલ- 5-કાર્બોક્સિલેટ []] અને (2-ગુનીડિનો-4-મેથિલ-1,3-થિયાઝોલ -5-યિલ) ઇથિલ એસિટેટ [10] સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ.ફેમોટિડાઇન []] માંથી સાંસદ બાયોમેડિકલ. -(4-ક્લોરોફેનાઇલ) -1,3-થિયાઝોલ-2-યિલ] ગુઆનિડાઇન [11] અને 1- [4- (3,4-ડાયમેથોક્સિફેનાઇલ) -1,3- થિયાઝોલ -2-યિલ] ગુઆનાઇડિન [12] મેટ્રિક્સ સાયન્ટિફિકથી. આ સંયોજનો વ્યાપારી રૂપે ઉપલબ્ધ છે. 100 મીમી સ્ટોક સોલ્યુશન બનાવવા માટે તેઓ ડ્રાય ડીએમએસઓમાં ઓગળી ગયા હતા, જે પછી ઇચ્છિત અંતિમ સાંદ્રતા પર રેકોર્ડિંગ સોલ્યુશનમાં પાતળા કરવામાં આવ્યા હતા. ઓછામાં ઓછી 99% શુદ્ધતા. જલીય હાઇડ્રોક્લોરિક એસિડ (2.5 એન) માં 2-એમિનો -4- (ટ્રાઇફ્લોરોમિથિલ) બેન્ઝેનેથિઓલ હાઇડ્રોક્લોરાઇડ (1.02 જી, 4.5 એમએમઓએલ) ના સસ્પેન્શન માટે, સોલિડ ડિસાઇન્ડિઆમાઇડ (380 મિલિગ્રામ, 4.5 એમએમઓએલ) ઉમેરવામાં આવ્યું હતું, અને પરિણામી હીટરોગેન મિશ્રણ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. 4 કલાક માટે ઉત્સાહી હલાવતા સાથે રિફ્લક્સ કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રતિક્રિયા મિશ્રણ ઓરડાના તાપમાને ઠંડુ કરવામાં આવ્યું હતું અને 10 એન પોટેશિયમ હાઇડ્રોક્સાઇડના ક્રમિક ઉમેરા દ્વારા તટસ્થ કરવામાં આવ્યું હતું. રચાયેલ સફેદ વરસાદને ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યો હતો, ઠંડા પાણી (3 × 50 મિલી) થી ધોવાઇ (3 × 50 મિલી) (3 × 50 મિલી). 65 ° સે) કેટલાક કલાકો સુધી, અને પછી સફેદ નક્કર (500 મિલિગ્રામ, 48 %) આપવા માટે ઇથિલ એસિટેટ/પેટ્રોલિયમ ઇથરથી ફરીથી સ્થાપિત; એમપી 221–222 ° સે (લાઇટ 225–226 ° સે) 45; 1 એચ એનએમઆર (500 મેગાહર્ટઝ, ડીએમએસઓ-ડી 6): Δ [પીપીએમ] = 7.25 (ખૂબ બ્રોડ એસ, 4 એચ), 7.40 (ડી, 1 એચ, જે = 8.1 હર્ટ્ઝ), 7.73 (એસ, 1 એચ), 7.92 (ડી. , 1 એચ, જે = 8.1 હર્ટ્ઝ) .13 સી એનએમઆર (200 મેગાહર્ટઝ, ડીએમએસઓ-ડી 6): Δ = 114.2 (ડી, જે = 3.5 હર્ટ્ઝ), 117.5 (ડી, જે = 3.5 હર્ટ્ઝ), 121.7, 124.6 (ક્યૂ, જે. = 272 હર્ટ્ઝ), 126.1 (ક્યૂ, જે = 272 હર્ટ્ઝ) = 31.6 હર્ટ્ઝ), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): M/z ગણતરી મૂલ્ય.ફોર સી 9 એચ 8 એફ 3 એન 4 એસ (એમ + એચ) +: 261.0416, : 261.0419. નેપ્થો [1,2-ડી] થિયાઝોલ-2-એમાઇન (300 મિલિગ્રામ, 1.5 એમએમઓએલ), જે અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું, તે નાના પરીક્ષણ ટ્યુબમાં તેલના સ્નાનમાં 200 ° સે ગરમ કરવામાં આવ્યું હતું .300 મિલિગ્રામ (મોટા વધારાની) સાયનામાઇડ અને 1.0 મિલી કોન્ક.ટાઇ કમ્પાઉન્ડ પર હાઇડ્રોક્લોરિક એસિડ ઝડપથી ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને મિશ્રણ લગભગ 2 મિનિટ સુધી તેલના સ્નાનમાં રાખવામાં આવ્યું હતું, તે સમય દરમિયાન મોટાભાગના પાણી બાષ્પીભવન કરવામાં આવ્યું હતું. પછી પ્રતિક્રિયા મિશ્રણ ઓરડાના તાપમાને ઠંડુ કરવામાં આવ્યું હતું અને પરિણામી નક્કર સામગ્રી નાના ટુકડા થઈને પાણીથી ધોવાઇ ગયું હતું જેથી નિસ્તેજ પીળો આકારહીન નક્કર. (38 મિલિગ્રામ, 10%) એમપી 246-250 ° સે; 1 એચ એનએમઆર (500 મેગાહર્ટઝ, ડીએમએસઓ-ડી 6, ડી 2 ઓ): Δ [પીપીએમ] = 7.59 (ટી, 1 એચ, જે = 8.2 હર્ટ્ઝ), 7.66 (ટી, 1 એચ, જે = 8.3 હર્ટ્ઝ), 7.77 (ડી, 1 એચ) . એમએચઝેડ, ડીએમએસઓ-ડી 6): Δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): એમ/ઝેડ ગણતરી મૂલ્ય. , મળી: 243.0704. પ્રોટોન પ્રવાહો pclamp10 સ software ફ્ટવેર સાથે એક્ષન ડિજિડેટા 1440 એ (મોલેક્યુલર ડિવાઇસીસ) દ્વારા નિયંત્રિત એક્સ op પ atch ચ 200 બી એમ્પ્લીફાયરનો ઉપયોગ કરીને વિવિધ બાંધકામો દર્શાવતા oc ઓસાઇટ્સના આંતરિક અને બાહ્ય પેચોમાં માપવામાં આવ્યા હતા. ઇન્ટ્રેસેલ્યુલર અને એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર સોલ્યુશન્સ સમાન રચના ધરાવે છે: 100 મીમી 2- (એન-મોર્ફોલિનો (એન-મોર્ફોલિનો) ) ઇથેનેસલ્ફોનિક એસિડ (એમઇએસ), 30 મીમી ટેટ્રાએથિલેમોનિયમ (ચા) મેસલેટ, 5 મીમી ટી ક્લોરાઇડ, 5 મીમી ઇથિલિન ગ્લાયકોલ-બિસ (2-એમિનોએથિલ) -એન, એન, એન ', એન'-ટેટ્રાસેટિક એસિડ (ઇજીટીએ), એડજસ્ટેડ ચા હાઇડ્રોક્સાઇડ સાથે પીએચ 6.0. બધા માપદંડો 22 ± 2 ° સે. પર કરવામાં આવ્યા હતા. પાઇપેટમાં 1.5-4 એમ.એ.નો resistance ક્સેસ પ્રતિકાર છે. વર્તમાન ટ્રેસ 1 કેહર્ટઝ પર ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યા હતા, 5 કેએચઝેડ પર નમૂના લેવામાં આવ્યા હતા અને ક્લેમ્પફિટ 10.2 (મોલેક્યુલર ડિવાઇસીસ સાથે વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યા હતા. ) અને મૂળ 8.1 (ઓરિજિનલેબ). એચવી 1 અવરોધક અને કેટલાક કિસ્સાઓમાં 10 મીમી βme ની વિવિધ સાંદ્રતા ધરાવતા ઉકેલો, વીસી -6 પરફ્યુઝન વાલ્વ સિસ્ટમ (વોર્નર ઇન્સ્ટ્ર.) સાથે જોડાયેલા મેનીફોલ્ડ દ્વારા ગુરુત્વાકર્ષણ દ્વારા સ્નાનમાં રજૂ કરવામાં આવ્યા હતા, જે પીસીએલએએમપી સ software ફ્ટવેર ટીટીએલ (ટ્રાંઝિસ્ટર- ટ્રાંઝિસ્ટર લોજિક) સિગ્નલ. રેપિડ પરફ્યુઝન પ્રયોગો મલ્ટિ-ટ્યુબ પરફ્યુઝન પેન્સિલ (સ્વચાલિત વિજ્ .ાન.) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યા હતા. +120 એમવી ડિપ્લોરાઇઝિંગ પલ્સ.જીવી માપન અગાઉ વર્ણવેલ 18,20. -40 એમવી પર -40 એમવી પર રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યા હતા, જ્યાં સુધી અન્યથા જણાવેલ ન હોય ત્યાં સુધી -20 એમવીથી +120 એમવીના જુદા જુદા વોલ્ટેજ પર ડિપ્લોરાઇઝેશન પગલાઓ પછી. પરીક્ષણ પલ્સ પહેલાંનો સંદર્ભ પલ્સ છે વર્તમાન સડો 18 માટે સુધારવા માટે વપરાય છે. જી.વી. ગ્રાફ બોલ્ટઝમેન સમીકરણને બંધબેસે છે: ચેનલો અને અવરોધકોના વિવિધ સંયોજનો માટે સ્પષ્ટ ડિસોસિએશન કોન્સ્ટન્ટ્સ (કેડી) (પૂરક કોષ્ટક 1) નિષેધની સાંદ્રતા પરાધીનતાને ફીટ કરીને નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા (સરેરાશ %અવરોધ મૂલ્યો) હિલ ઇક્વેશન સાથે: જ્યાં [i] અવરોધક I અને H ની સાંદ્રતા છે તે ટેકરી ગુણાંક છે. ટેકરી ગુણાંકની ગણતરી કરવા માટે, સમીકરણ (2) ને ફરીથી ગોઠવવામાં આવ્યું છે: