ಮಾನವ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಜೀವಾಣುಗಳ ಉಷ್ಣವಲಯವನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಜಾತಿಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಬಳಸಿ

ಅನೇಕ ರೋಗಕಾರಕಗಳು ತಮ್ಮ ನೈಸರ್ಗಿಕ ಅತಿಥೇಯಗಳ ವಿರುದ್ಧ ವೈರಲೆನ್ಸ್ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಉತ್ಪತ್ತಿ ಮಾಡುತ್ತವೆ. ಪ್ರಾಯೋಗಿಕವಾಗಿ, ಮೆಥಿಸಿಲಿನ್-ನಿರೋಧಕ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ (MRSA) ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಗಳು ಮನುಷ್ಯರಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಮಾನವ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವೈರಸ್ ಅಂಶಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು ಉತ್ಪತ್ತಿ ಮಾಡುತ್ತವೆ. ಅಂತಹ ಒಂದು ಅಂಶವೆಂದರೆ LukAB, ಇತ್ತೀಚಿಗೆ ಕಂಡುಹಿಡಿದ ರಂಧ್ರ-ರೂಪಿಸುವ ಟಾಕ್ಸಿನ್, ಇದು ಸಮಗ್ರ ಘಟಕ CD11b ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮಾನವ ಫಾಗೊಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸುತ್ತದೆ. LukAB ಮಾನವನ CD11b ಗೆ ಬಲವಾದ ಉಷ್ಣವಲಯವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ದಂಶಕಗಳಿಗೆ ಅಲ್ಲ. ಇಲ್ಲಿ, ಫೈಲೋಜೆನೆಟಿಕ್ ಮತ್ತು ಜೀವರಾಸಾಯನಿಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಮಾನವನ CD11b ಗೆ LukAB ಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಾದ 11 ಶೇಷ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಕಾರಣವಾಗಿವೆ, ಇದು ಮ್ಯೂರಿನ್ CD11b ಅನ್ನು ಟಾಕ್ಸಿನ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವಂತೆ ಮಾಡಲು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ಡೊಮೇನ್ ಅನ್ನು ಬದಲಿಸಲು CRISPR-ಮಧ್ಯಸ್ಥ ಜೀನ್ ಎಡಿಟಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ "ಮಾನವೀಕರಿಸಿದ" ಇಲಿಗಳು. ವಿವೋ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ ಮಾನವೀಕರಿಸಿದ ಇಲಿಗಳು ಎಮ್ಆರ್ಎಸ್ಎ ರಕ್ತಪ್ರವಾಹದ ಸೋಂಕಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಸಂವೇದನಾಶೀಲವಾಗಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಲುಕಾಬಿ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯಿಂದ ಫಿನೋಟೈಪ್). ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ಅಧ್ಯಯನಗಳು LukAB ಅನ್ನು MRSA ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಪ್ರಮುಖ ವಿಷವಾಗಿ ಸ್ಥಾಪಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು MRSA ಯ ರೋಗಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಹೊಸ ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ.
ಮಾನವರಿಗೆ, ಹಲವಾರು ಮಾರಣಾಂತಿಕ ಮತ್ತು ಸಾಮಾನ್ಯ ರೋಗಕಾರಕಗಳು ಜಾತಿ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿವೆ ಮತ್ತು ಮನುಷ್ಯರಿಗೆ ಅಥವಾ ಮಾನವರಲ್ಲದ ಸಸ್ತನಿಗಳಿಗೆ ಮಾತ್ರ ಸೋಂಕು ತರಬಹುದು (1). ಇತರ ಮಾನವ ರೋಗಕಾರಕಗಳು ವ್ಯಾಪಕ ಶ್ರೇಣಿಯ ಜಾತಿಗಳನ್ನು ಸೋಂಕು ತಗುಲಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ, ಆದರೆ ಈ ಸೋಂಕುಗಳು ಮಾನವ ರೋಗಗಳನ್ನು ನಿಷ್ಠೆಯಿಂದ ಸಾರಾಂಶ ಮಾಡುವುದಿಲ್ಲ. ಅತಿಥೇಯ ಉಷ್ಣವಲಯವನ್ನು ಆತಿಥೇಯ ಸೀಮಿತಗೊಳಿಸುವ ಅಂಶಗಳು, ರೋಗಕಾರಕ ಆಕ್ರಮಣ ಅಥವಾ ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಾದ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯಾಗದ ಗ್ರಾಹಕಗಳು, ಆತಿಥೇಯರ ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯೊಂದಿಗಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳು ಅಥವಾ ಪೋಷಕಾಂಶಗಳ ಬಳಕೆಯಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಬಹುದು (1). ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಗಳು ಮತ್ತು ಅತಿಥೇಯಗಳ ಸಹ-ವಿಕಾಸವು ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಗಳ ಉಳಿವು ಮತ್ತು ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿಗಾಗಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಹೋಸ್ಟ್-ರೋಗಕಾರಕ ಸಂವಹನಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಆತಿಥೇಯ ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಅಂಶಗಳು ಮತ್ತು ರೋಗಕಾರಕ-ಉದ್ದೇಶಿತ ಅಣುಗಳು ರೋಗಕಾರಕಗಳಿಂದ ಗುರುತಿಸಲ್ಪಡುವುದನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ವಿಕಸನಗೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಅವರು ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಬಹುದು. ಈ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು "ಆಣ್ವಿಕ ಶಸ್ತ್ರಾಸ್ತ್ರಗಳ ಓಟ" ಎಂದು ಬಿಚ್ಚಿಡಬಹುದು, ಇದರಲ್ಲಿ ರೋಗಕಾರಕಗಳು ಮತ್ತು ಅತಿಥೇಯಗಳು ಬದುಕಲು ನಿರಂತರವಾಗಿ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳಬೇಕು. ಆದ್ದರಿಂದ, ರೋಗಕಾರಕಗಳು ತಮ್ಮ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಹೊಂದುತ್ತಿರುವ ಜಾತಿಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣತಿ ಹೊಂದಬಹುದು.
ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯ ಸರಿಸುಮಾರು 30% ರಷ್ಟಿದೆ ಮತ್ತು ಇದು ಮೂಗಿನ ಹೊಳ್ಳೆಗಳು, ಚರ್ಮ ಮತ್ತು ಜಠರಗರುಳಿನ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿದೆ (2). ಆದಾಗ್ಯೂ, ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಆಳವಾದ ಅಂಗಾಂಶಗಳಿಗೆ ಪ್ರವೇಶಿಸಿದಾಗ, ಇದು ಚರ್ಮ ಮತ್ತು ಮೃದು ಅಂಗಾಂಶಗಳ ಸೋಂಕುಗಳು, ಎಂಡೋಕಾರ್ಡಿಟಿಸ್, ನ್ಯುಮೋನಿಯಾ, ಆಸ್ಟಿಯೋಮೈಲಿಟಿಸ್, ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಮಿಯಾ ಮತ್ತು ಸೆಪ್ಸಿಸ್ ಸೇರಿದಂತೆ ವಿವಿಧ ಮತ್ತು ಗಂಭೀರವಾದ ಸೋಂಕುಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು. ಇದು ಸುಮಾರು 500,000 ಆಸ್ಪತ್ರೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ (3, 4). ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಜಾನುವಾರು (5) ಮತ್ತು ದಂಶಕಗಳಲ್ಲಿ (6) ರೋಗಗಳನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತದೆ. ಈ ಪ್ರಾಣಿ-ಸಂಬಂಧಿತ ತಳಿಗಳು ಮಾನವರಿಂದ ಹುಟ್ಟಿಕೊಂಡಿವೆ, ಆದರೆ ಅವುಗಳ ಪ್ರಾಣಿ ಸಂಕುಲಗಳಿಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾದ ಹೊಸ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಪಡೆದುಕೊಂಡಿವೆ ಮತ್ತು ಕೆಲವು ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಮಾನವ ರೋಗಕಾರಕಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಜೀನ್‌ಗಳ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಕಳೆದುಕೊಂಡಿವೆ (7).
ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಿದರೆ, ಮಾನವ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ನ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕವಾಗಿ ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಗಳು ಸೋಂಕಿನ ಹಲವಾರು ಮಾರ್ಗಗಳ ಮೂಲಕ ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ರೋಗವನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡಬಹುದು. ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಸೋಂಕಿನ ಬಗ್ಗೆ ಅನೇಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳನ್ನು ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಗಿದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಮಾದರಿಗಳು ಮಾನವ ರೋಗಗಳನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಅನುಕರಿಸುವುದಿಲ್ಲ (8). ಇದುವರೆಗೆ ಪ್ರಿಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಮ್ಯೂರಿನ್ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಇದು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿತ್ವವನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆಯಾದರೂ, ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಲಸಿಕೆಗಳ ಎಲ್ಲಾ ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳು ಇಲ್ಲಿಯವರೆಗೆ ವಿಫಲವಾಗಿವೆ. ಈ ಅಂಶವು ಈ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ತಮವಾಗಿ ವಿವರಿಸಬಹುದು. ಮಾನವ-ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ತಳಿಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ರೋಗಗಳನ್ನು ಪುನರಾವರ್ತಿಸುವ ಈ ಮಾದರಿಗಳ ನ್ಯೂನತೆಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ವೈರಲೆನ್ಸ್ ಅಂಶಗಳ (8, 9) ಜಾತಿಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯಿಂದ ಭಾಗಶಃ ವಿವರಿಸಬಹುದು. ಅಂತಹ ಒಂದು ಅಂಶವೆಂದರೆ ಎರಡು-ಘಟಕ ಪೊರೊಜೆನ್ LukAB (9, 10) [ಇದನ್ನು LukGH (11) ಎಂದೂ ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ]. LukAB ರಿಸೆಪ್ಟರ್ CD11b ಗೆ ಬಂಧಿಸಿದ ನಂತರ (αMβ2 ಇಂಟೆಗ್ರಿನ್ (MAC-1 ಮತ್ತು CR3 ಎಂದೂ ಸಹ ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ) ಒಂದು ಘಟಕ), ಇದು ಗುರಿಯ ಜೀವಕೋಶ ಪೊರೆಯ ಕೋಶ (12) ನಲ್ಲಿ ರಂಧ್ರಗಳನ್ನು (10, 11) ರೂಪಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮಾನವ ಫಾಗೊಸೈಟೋಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಗುರಿಯಾಗಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕೊಲ್ಲುತ್ತದೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ, LukAB CD11b ನ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಬಂಧದೊಂದಿಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ (12). LukAB ಮಾನವ ಸೋಂಕಿನ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುತ್ತದೆ (13), 99% ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಅನುಕ್ರಮ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಐಸೊಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (14) ಕಂಡುಬಂದಿದೆ ಮತ್ತು ಮೆಥಿಸಿಲಿನ್-ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಮತ್ತು ಮೆಥಿಸಿಲಿನ್-ನಿರೋಧಕ S- ಅವಧಿಯ ಡೆಡ್ ಪ್ರೈಮರಿ ಹ್ಯೂಮನ್ ಫಾಗೊಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಕೊಲ್ಲುವ ಇನ್ ವಿಟ್ರೊ ಸೋಂಕಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಿದೆ. . ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಗಳು (MSSA ಮತ್ತು MRSA ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ) (10, 11). ಆದ್ದರಿಂದ, ಆತಿಥೇಯರ ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮತ್ತು ಸಂಭಾವ್ಯ ಔಷಧ ಗುರಿಗಳನ್ನು ನಿವಾರಿಸಲು LukAB ಅನ್ನು ಪ್ರಮುಖ ವೈರಲೆನ್ಸ್ ಅಂಶವೆಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಲುಕಾಬಿಯು ಮ್ಯೂರಿನ್ ಕೋಶಗಳ ಮೇಲೆ ಕಡಿಮೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ (12, 15), ಇದು ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್‌ನಲ್ಲಿನ ವಿಷದ ರೋಗಕಾರಕತೆಯ ಮೇಲಿನ ವಿವೋ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ ಅಡ್ಡಿಯಾಗುತ್ತದೆ. ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್ (12) ನೊಂದಿಗೆ 78% ಅಮೈನೋ ಆಸಿಡ್ ಗುರುತನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೂ, LukAB ಗೆ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಕಡಿಮೆ-ಸಂಬಂಧದಿಂದ ಮ್ಯೂರಿನ್ CD11b I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ ವಿವರಿಸಬಹುದು.
ಇಲ್ಲಿ, ನಾವು LukAB ನ ಜಾತಿಯ ಉಷ್ಣವಲಯದ ವಿಸ್ತಾರವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಹೊರಟಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಒಳಗಾಗುವ ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ರಚಿಸಲು ಈ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇವೆ. ನಾವು ವಿವಿಧ ಸಸ್ತನಿಗಳಿಂದ CD11b I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ LukAB ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಈ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಪ್ರೈಮೇಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ದಂಶಕಗಳಲ್ಲಿನ CD11b I ಡೊಮೇನ್‌ನ ವಿಕಸನೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಲುಕಾಬ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಉಳಿಕೆಗಳು ಸೇರಿದಂತೆ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಧನಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಉಳಿಕೆಗಳು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಪೂರಕ ವಿಧಾನವು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದೆ. I ಡೊಮೇನ್ ಚೈಮೆರಾಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗೆ ಅಗತ್ಯವಾದ ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ನ 11 ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ನಾವು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಜ್ಞಾನದೊಂದಿಗೆ ಶಸ್ತ್ರಸಜ್ಜಿತವಾದ, ನಾವು ಮ್ಯೂರಿನ್ CD11b I ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ ಮಾನವೀಕರಿಸಿದ LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಲು ಮ್ಯೂರಿನ್ ಜೀನೋಮ್ ಅನ್ನು ಸಂಪಾದಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಮಾನವೀಕರಿಸಿದ ಇಲಿಗಳು ಲುಕಾಬಿ-ಅವಲಂಬಿತ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ MRSA ಸೋಂಕಿಗೆ ಒಳಗಾದ ನಂತರ, ಅವುಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸೋಂಕಿನ ಒಳಗಾಗುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೊರೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದವು. ಆದ್ದರಿಂದ, ಫೈಲೋಜೆನಿ, ಬಯೋಕೆಮಿಸ್ಟ್ರಿ ಮತ್ತು ಜೆನೆಟಿಕ್ ಇಂಜಿನಿಯರಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಮೂಲಕ, ಹೊಸ ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಯ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಸೋಂಕಿನ ರೋಗಶಾಸ್ತ್ರದಲ್ಲಿ ಮಾನವ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವೈರಸ್ ಅಂಶಗಳ ಪಾತ್ರವನ್ನು ನಾವು ಸ್ಥಾಪಿಸಿದ್ದೇವೆ.
ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಲುಕಾಬ್ ಮಾನವರು ಮತ್ತು ಸೈನೊಮೊಲ್ಗಸ್ ಕೋತಿಗಳಲ್ಲಿ ನ್ಯೂಟ್ರೋಫಿಲ್‌ಗಳನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಗುರಿಯಾಗಿಸಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸಿವೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, LukAB ಕಡಿಮೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿರುವ ಮೊಲದ ನ್ಯೂಟ್ರೋಫಿಲ್‌ಗಳನ್ನು ಗುರಿಪಡಿಸುತ್ತದೆ, ಅದರ EC50 (ಮಧ್ಯಮ ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಸಾಂದ್ರತೆ) ಯಿಂದ ಸಾಕ್ಷಿಯಾಗಿದೆ, ಇದು ಮಾನವ ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ ಸುಮಾರು 100 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಕಡಿಮೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿರುವ ಇಲಿಗಳಿಗೆ, ಅದರ EC50 ಮಾನವ ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗಿಂತ 2000 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚು (15)) . ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು LukAB ಮರುಸಂಯೋಜಿತ ಹ್ಯೂಮನ್ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುವ ಅಧ್ಯಯನಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಮೌಸ್ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಿಗೆ ಅದರ ಬಂಧವು ದುರ್ಬಲವಾಗಿದೆ ಅಥವಾ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ (12). ವಿವಿಧ ಸಸ್ತನಿಗಳಿಂದ (ಚಿತ್ರ 1, A ಮತ್ತು B) ಮರುಸಂಯೋಜಕ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು LukAB ಅನ್ನು ಮರುಸಂಯೋಜಕ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸುವುದನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಾವು ಈ ಅಧ್ಯಯನಗಳನ್ನು ವಿಸ್ತರಿಸುತ್ತೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1C). ನಿರೀಕ್ಷೆಯಂತೆ, LukAB ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಸ್ಯಾಚುರಬಲ್ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, LukAB ಮೌಸ್ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ದುರ್ಬಲವಾಗಿ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮಧ್ಯಮ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಮೊಲ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ದುರ್ಬಲವಾಗಿ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ. ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಕುದುರೆಗಳು, ರೀಸಸ್ ಮಂಗಗಳು ಮತ್ತು ಹಂದಿಗಳ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಿಗೆ LukAB ಬಲವಾಗಿ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1C). LukAB ಅನ್ನು ಇಲಿ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುವ ವಿಧಾನವು ಮೊಲ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಮಧ್ಯಂತರ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಚೀನೀ ಹ್ಯಾಮ್‌ಸ್ಟರ್‌ಗಳು, ಕುರಿ ಮತ್ತು ಜಾನುವಾರುಗಳ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯು ಬಹುತೇಕ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 1C). LukAB ಗೆ ದೃಢವಾಗಿ ಬಂಧಿಸುವ I ಡೊಮೇನ್ ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ > 80% ಹೋಮಾಲಜಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಆದರೆ ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ (A) ವಿವಿಧ ಜಾತಿಗಳ CD11b I ಡೊಮೇನ್‌ನ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಗುರುತಿನ ಶೇಕಡಾವಾರು ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಆಧರಿಸಿದ ಫೈಲೋಜೆನೆಟಿಕ್ ಮರ. (B) 1 μg LukAB ಮತ್ತು I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳ ಕೂಮಾಸ್ಸಿ ಸ್ಟೇನಿಂಗ್. (C) ಅಳತೆ ಮಾಡಿದಂತೆ, (A) ನಲ್ಲಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ ಜಾತಿಗಳ ಮರುಸಂಯೋಜನೆ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ LukAB ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದು. ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಬದ್ಧವಾಗಿರುವ LukAB ನ 450 nm ನಲ್ಲಿ ಗರಿಷ್ಠ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಗೆ ಡೇಟಾವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಸರಾಸರಿ ± SEM ಎಂದು ಡೇಟಾವನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮೌಸ್ I ಡೊಮೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಮಹತ್ವವನ್ನು ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಎರಡು-ಮಾರ್ಗದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (****P CD11b 40 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ವಿವಿಧ ಲಿಗಂಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಗ್ರಾಹಕವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರ ವಹಿಸುತ್ತದೆ. CD11b ನಾಕ್‌ಔಟ್ ಇಲಿಗಳು ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಯ ಸೆಪ್ಸಿಸ್ (16) ಮತ್ತು ಬಹು ಸೋಂಕುಗಳಿಗೆ (17, 18) ಒಳಗಾಗುವಿಕೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿವೆ. CD11b ಅನ್ನು LukAB ಮತ್ತು ಇತರ ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಗಳು ಮತ್ತು ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಯ ಅಂಶಗಳ (12, 19-22) ಸರಣಿಯ ಗುರಿಯಾಗಿಯೂ ಬಳಸಬಹುದು. ಆದ್ದರಿಂದ, CD11b ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಕಾರ್ಯದಲ್ಲಿ ತನ್ನ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಂಡು, ವೈರಲೆನ್ಸ್ ಅಂಶಗಳಿಂದ ಗುರುತಿಸಲ್ಪಡದಂತೆ ಆಯ್ದ ಒತ್ತಡದಲ್ಲಿರಬಹುದು.
CD11b ಯ ವಿಕಾಸವನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ನಾವು 19 ಆಂಥ್ರೊಪೊಮಾರ್ಫಿಕ್ ಪ್ರೈಮೇಟ್ ಜಾತಿಗಳ (ಟೇಬಲ್ S1) ಮತ್ತು 13 ದಂಶಕ ಜಾತಿಗಳ (ಟೇಬಲ್ S2) ಮಾದರಿಗಳಿಂದ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾದ ಅನುಕ್ರಮಗಳ ಮೇಲೆ ಫೈಲೋಜೆನೆಟಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ. ನಾವು ಫೈಲೋಜೆನೆಟಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪೂರಕ ಗರಿಷ್ಠ ಸಾಧ್ಯತೆಗಳನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇವೆ [ಗರಿಷ್ಠ ಸಂಭವನೀಯತೆಯ ಮೂಲಕ ಭೌತಿಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (PAML)] ಮತ್ತು ಬೇಸಿಯನ್ [ಹೈಫೈ: ಎವಲ್ಯೂಷನರಿ ಮಿಕ್ಸ್ಡ್ ಎಫೆಕ್ಟ್ಸ್ ಮಾಡೆಲ್ (MEME) ಮತ್ತು ಫಾಸ್ಟ್ ಅನ್ಬಯಾಸ್ಡ್ ಬೇಯ್ಸ್ ಅಂದಾಜು (FUBAR)] ಅಲ್ಲದ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು ಇದನ್ನು ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ. CD11b ಕೋಡಿಂಗ್ ಅನುಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಾನಕ್ಕೆ ಸಮಾನಾರ್ಥಕ ಮತ್ತು ಸಮಾನಾರ್ಥಕ ಪರ್ಯಾಯ ದರಗಳು (dN / dS). ಪ್ರೈಮೇಟ್ ಮತ್ತು ದಂಶಕ ಕ್ಲೇಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, CD11b (ಚಿತ್ರ 2A) (ಟೇಬಲ್ S3) ನಲ್ಲಿನ ಬಹು ಶೇಷಗಳಿಗೆ dN/dS ಮೌಲ್ಯಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ. ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ITGAM (CD11b ಕೋಡಿಂಗ್ ಜೀನ್) ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಧನಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆಗೆ ಒಳಗಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಅನೇಕ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಸಹಜ ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣಾ ಅಂಶಗಳನ್ನು (23, 24) ನೆನಪಿಸುತ್ತದೆ. ಧನಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆಗೆ ಒಳಗಾಗುವ ಸೈಟ್‌ಗಳು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ CD11b I ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರೀಕೃತವಾಗಿವೆ (ಚಿತ್ರ 2A), ಇದು ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಲಿಗಂಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು LukAB (25) ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ.
(A) ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ CD11b ನಲ್ಲಿ ಎಪಿಸೋಡಿಕ್ (MEME ಮತ್ತು PAML) ಮತ್ತು ಪ್ರವೇಶಸಾಧ್ಯತೆ (FUBAR) ಧನಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆಗೆ ಒಳಗಾಗುವ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ತ್ರಿಕೋನಗಳಿಂದ ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (B) ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ನ ರಚನೆ [ಪ್ರೋಟೀನ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್ (PDB) ID: 1IDO]. ಉಳಿಕೆಗಳು ಧನಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿವೆ [FUBAR (P> 0.9); PAML (M7 ವಿರುದ್ಧ M8, P≤0.05); MEME (P≤0.05)] ಅನ್ನು ಗೋಳಗಳಾಗಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ. (C ಯಿಂದ E) ವಿವಿಧ ಪ್ರೈಮೇಟ್‌ಗಳು (D) ಮತ್ತು ದಂಶಕಗಳಿಂದ (E) I ಡೊಮೇನ್ ಮ್ಯುಟೆಂಟ್ಸ್ (C) ಮತ್ತು I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಿಗೆ LukAB ನ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಬದ್ಧವಾಗಿರುವ LukAB ನ 450 nm ನಲ್ಲಿ ಗರಿಷ್ಠ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಗೆ ಡೇಟಾವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಸರಾಸರಿ ± SEM ಎಂದು ಡೇಟಾವನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಎರಡು-ಮಾರ್ಗದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ಮಹತ್ವವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (**** P CD11b I ಡೊಮೇನ್‌ನೊಳಗಿನ ಸೈಟ್‌ಗಳ ಧನಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆಯ ಸಹಿಯು LukAB ಸೇರಿದಂತೆ ರೋಗಕಾರಕಗಳಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ವೈರಲೆನ್ಸ್ ಅಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ನಡೆಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಮಂಗಗಳು ಮತ್ತು ದಂಶಕಗಳ ಕ್ಲಾಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಸ್ಥಾನಗಳು 164, 222 ಮತ್ತು 294 ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಲ್ಲಿ (PAML, MEME ಮತ್ತು FUBAR) ಸಾರ್ವತ್ರಿಕ ಧನಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆಯ ಹಂಚಿಕೆಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2B). ಈ ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿನ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಬದಲಾವಣೆಗಳು CD11b ಮತ್ತು LukAB ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತವೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು, ನಾವು ಮಾನವ ಮತ್ತು ಮೌಸ್ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಈ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ರೂಪಾಂತರಗೊಳಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ S1A). ಹ್ಯೂಮನ್ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಮಾನವರಲ್ಲಿ 294 ನೇ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಗ್ಲುಟಾಮಿಕ್ ಆಮ್ಲದ (E294) ರೂಪಾಂತರವು ಪ್ರೋಲಿನ್ (ಮೌಸ್ ಶೇಷ) ಅಥವಾ ಲೈಸಿನ್ (ಮೂಲ ಶೇಷ) ಲುಕಾಬ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹ ಇಳಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಮೌಸ್ I ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ 294 ನೇ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಲೈನ್ ಅನ್ನು ಗ್ಲುಟಾಮಿಕ್ ಆಸಿಡ್ (P294E) ಗೆ ಪರಿವರ್ತಿಸುವುದರಿಂದ LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ, ಇದು LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗೆ ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ ಇತರ ಶೇಷಗಳ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಸ್ಥಾನ 164 ರಲ್ಲಿ ಹಿಸ್ಟೈಡಿನ್ ಮತ್ತು 222 ರಲ್ಲಿ ಲ್ಯೂಸಿನ್ ಮುರಿನ್ ಶೇಷಕ್ಕೆ (H164IL222N) ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ LukAB ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ. ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ LukAB ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದು (ಎಲ್ಲಾ ಮೂರು ಅವಶೇಷಗಳು ಮ್ಯೂರಿನ್ ಅವಶೇಷಗಳಿಗೆ ರೂಪಾಂತರಗೊಂಡಿವೆ) E294P ಮತ್ತು E294K ಅನ್ನು ಹೋಲುತ್ತವೆ, 164 ಮತ್ತು 222 ಶೇಷಗಳು ಟಾಕ್ಸಿನ್-ರಿಸೆಪ್ಟರ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಭಾಗವಹಿಸದಿರಬಹುದು, ಆದರೆ ಇತರ CD11b- ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸಬಹುದು. ರೋಗಕಾರಕಗಳು.
ಮುಂದೆ, ನಾವು ಇತರ ಪ್ರೈಮೇಟ್‌ಗಳ I ಡೊಮೇನ್‌ನ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅದನ್ನು ನಮ್ಮ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 164, 222 ಮತ್ತು 294 ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿ ಮಾನವ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಸಂಕೇತಗಳಿಂದ ಭಿನ್ನವಾಗಿದೆ. ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್ (89%) ನೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಹೋಮಾಲಜಿ ಹೊರತಾಗಿಯೂ. ಅಂಗೋಲಾ ಕೊಲೋಬಸ್‌ನ I ಡೊಮೇನ್ LukAB ಗೆ ಕಡಿಮೆ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2, D ನಿಂದ F). I ಡೊಮೇನ್ 294 ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಲ್ಯೂಸಿನ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ ಎಂಬ ಅಂಶದಿಂದ ಈ ಕಡಿಮೆ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ವಿವರಿಸಬಹುದು (ಚಿತ್ರ 2, D ನಿಂದ F). ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಗೋಲ್ಡನ್ ನೋಸ್ ಮಂಕಿ ಈ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಲ್ಯೂಸಿನ್ ಅನ್ನು ಸಹ ಹೊಂದಿದೆ, ಆದರೆ ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ LukAB ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದು ಮತ್ತು I ಡೊಮೇನ್‌ನ ಬೈಂಡಿಂಗ್. ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ಸಂಶೋಧನೆಗಳು LukAB ಬಂಧಿಸುವ ಸೈಟ್‌ಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯ ಸಂಯೋಜಿತ ಕೊಡುಗೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.
ನಾವು ಇತರ ದಂಶಕಗಳ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ LukAB ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದನ್ನು ಸಹ ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಆರ್ಡ್‌ನ ಕಾಂಗರೂ ಇಲಿ I ಡೊಮೇನ್ ಮುರಿನ್ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಉತ್ತಮ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 2E). ಆರ್ಡ್‌ನ ಕಾಂಗರೂ ಇಲಿ I ಡೊಮೇನ್ 294 ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಗ್ಲುಟಾಮಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಇದನ್ನು ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂರಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸೈಟ್ ಸುತ್ತಲಿನ ಲೂಪ್ ಮನುಷ್ಯರನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ರಕ್ಷಿಸುತ್ತದೆ. ಈ I ಡೊಮೇನ್ ಮತ್ತು ಹ್ಯೂಮನ್ I ಡೊಮೇನ್ ನಡುವಿನ ಒಟ್ಟು ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಗುರುತು ಕೇವಲ 78% (ಚಿತ್ರ 2F) ಆಗಿದ್ದರೂ, Ord ಕಾಂಗರೂ ಇಲಿಯ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ LukAB ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸಲು ಈ ಲೂಪ್ ಬಹಳ ಮುಖ್ಯ ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸಿದ್ದೇವೆ.
ಒಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ, ಆಯ್ದ ಶೇಷಗಳಲ್ಲಿ (ವಿಶೇಷವಾಗಿ I ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ) ITGAM ಧನಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆಗಳ ಸರಣಿಗೆ ಒಳಗಾಗಿದೆ ಎಂದು ಈ ಡೇಟಾ ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ನಾವು ಸೈಟ್ 294 ಅನ್ನು ಅಂತಹ ಒಂದು ಸೈಟ್ ಎಂದು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗೆ ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ.
CD11b I ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಇಂಟರ್‌ಫೇಸ್ ಅನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ವಿಭಜಿಸಲು, ನಾವು ಮಾನವ ಮತ್ತು ಮೌಸ್ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳ (ಚಿತ್ರ 3A) ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಹೋಲಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್ ರಚನೆಯ ಮೇಲೆ ವಿವಿಧ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ಮ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ (26). ವಿವಿಧ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು ಮೇಲ್ಮೈಗೆ ತೆರೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 3B). I ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿನ ಸ್ಥಾನದ ಪ್ರಕಾರ, ನಾವು ವಿವಿಧ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು 7 ಗುಂಪುಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸುತ್ತೇವೆ (ಚಿತ್ರ 3, A ಮತ್ತು B). ಹ್ಯೂಮನ್ I ಡೊಮೇನ್ ಬೆನ್ನೆಲುಬಿನಲ್ಲಿನ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಏಳು ಗುಂಪುಗಳಿಂದ ಮುರಿನ್ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಚಿಮೆರಿಕ್ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು (HMH ಚೈಮೆರಾಸ್) ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅಧ್ಯಯನಕ್ಕಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ S2, A ಮತ್ತು B). LukAB ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ (WT) ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಿಗೆ (ಚಿತ್ರ 3C) ಹೋಲುವ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ HMH ಚೈಮೆರಾಸ್ 1 ರಿಂದ 6 ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ. ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, HMH ಚಿಮೆರಾ 7 ಗೆ LukAB ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದು ದುರ್ಬಲವಾಗಿದೆ.
(A) ಮೌಸ್ ಮತ್ತು ಹ್ಯೂಮನ್ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳ ಅಮಿನೊ ಆಸಿಡ್ ಜೋಡಣೆ. ವಿವಿಧ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಬಣ್ಣವು ವಿಭಿನ್ನ I ಡೊಮೇನ್ ಚೈಮೆರಾವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ. (B) ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ನ ರಚನೆ (PDB ID: 1IDO). ಮೌಸ್ I ಡೊಮೇನ್‌ನ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಬೂದು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರದೇಶದ ಬಣ್ಣವನ್ನು (A) ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. (C ಯಿಂದ E) LukAB ಮಾನವ, ಮೌಸ್, HMH ಚೈಮೆರಾ (ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್ ಬೆನ್ನೆಲುಬಿನಲ್ಲಿ ಮೌಸ್ ಅವಶೇಷಗಳು) (C ನಿಂದ E) ಮತ್ತು MHM ಚಿಮೆರಾ (ಮೌಸ್ I ಡೊಮೇನ್ ಬೆನ್ನೆಲುಬಿನಲ್ಲಿನ ಮಾನವ ಅವಶೇಷಗಳು) (D ಮತ್ತು E) I-ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ . HMH 7289-316 ಮತ್ತು MHM 7289-316 ಕ್ರಮವಾಗಿ HMH 7 ಮತ್ತು MHM 7 ಅನ್ನು (C ಮತ್ತು D) (E) ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಬದ್ಧವಾಗಿರುವ LukAB ನ 450 nm ನಲ್ಲಿ ಗರಿಷ್ಠ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಗೆ ಡೇಟಾವನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಸರಾಸರಿ ± SEM ಎಂದು ಡೇಟಾವನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮಾನವ (C) ಅಥವಾ ಮೌಸ್ (D) I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಮಹತ್ವವನ್ನು ಎರಡು-ಮಾರ್ಗ ANOVA (**** P ಮೌಸ್ I ಡೊಮೇನ್ ಬ್ಯಾಕ್‌ಬೋನ್‌ನಲ್ಲಿ (MHM ಚಿಮೆರಾ) ಅದೇ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ಮಾನವ ಅವಶೇಷಗಳಿಗೆ ರೂಪಾಂತರಿಸುವ ರಿವರ್ಸ್ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನೂ ನಾವು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ. LukAB ಅನ್ನು MHM ಚೈಮೆರಾಸ್ 1 ರಿಂದ 6 ರವರೆಗೆ ಬಂಧಿಸುವುದು ದುರ್ಬಲವಾಗಿದ್ದರೂ, MHM 7 ಗೆ ಟಾಕ್ಸಿನ್ ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವ ಮಟ್ಟವು ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ನಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 2D). ಆದ್ದರಿಂದ, 289 ರಿಂದ 316 ರವರೆಗಿನ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪ್ರದೇಶ 7, ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ LukAB ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸಲು ಅವಶ್ಯಕವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಮ್ಯೂರಿನ್ I ಡೊಮೇನ್ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವಂತೆ ಮಾಡಲು ಇದು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ. ಗ್ಲುಟಮೇಟ್ 294 ಈ ಪ್ರದೇಶದೊಳಗೆ ಬರುತ್ತದೆ ಎಂದು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಅಂಶವಾಗಿದೆ, ಇದು LukAB/I ಡೊಮೇನ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಈ ಶೇಷದ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ.
ಚಿಮೆರಾ 7 ರಲ್ಲಿನ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು ಸುರುಳಿಯ ರಚನೆಯ ಲೂಪ್ ಮತ್ತು ಭಾಗವನ್ನು ವ್ಯಾಪಿಸಿವೆ ಮತ್ತು I ಡೊಮೇನ್‌ನ ಲೋಹದ ಅಯಾನು-ಅವಲಂಬಿತ ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳುವ ಸೈಟ್‌ಗೆ (MIDAS) ಹತ್ತಿರದಲ್ಲಿದೆ. ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ CD11b ಲಿಗಂಡ್‌ಗಳ (27) ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಗೆ ಈ ಸೈಟ್‌ನಲ್ಲಿನ ಡೈವೇಲೆಂಟ್ ಕ್ಯಾಶನ್ ಅತ್ಯಗತ್ಯವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಈ ಪ್ರದೇಶವು LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗೆ ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಬಹುದು. ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು ಮುಂದೆ CD11b I ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಇತರ ಚೈಮೆರಾಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ ನಂತರ ಮತ್ತು ಚೈಮೆರಾ 7 ರಲ್ಲಿ ಹೊಂದಿಸಲಾದ ಸಣ್ಣ ಶೇಷವನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ ನಂತರ, ಮುರಿಡೇ I ಡೊಮೇನ್ ಬೆನ್ನೆಲುಬಿನೊಂದಿಗಿನ ಚೈಮೆರಾವು 292 ರಿಂದ 295 (MHM 7292–295) (MHM 7292–295) (ಚಿತ್ರ 3E) ಲುಕಾಬಿ ಸಂಯೋಜನೆಯಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್ ಮತ್ತು ಪೂರ್ಣ ಉದ್ದದ MHM 7 (MHM 7289-316) ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಹೋಲುತ್ತದೆ. ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಮೌಸ್ I ಡೊಮೇನ್ ಬೆನ್ನೆಲುಬಿನಲ್ಲಿ (MHM 7289, 298-316) ಮಾನವ ಅನುಕ್ರಮದ 292 ರಿಂದ 295 ರ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ, MHM 7 ನಲ್ಲಿ ನಾವು ಇತರ ರೂಪಾಂತರಿತ ಶೇಷಗಳನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಿದರೆ, LukAB ಕಳಪೆಯಾಗಿ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೌಸ್ I ರಚನೆಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ. ಡೊಮೇನ್‌ಗಳು ಹೋಲುತ್ತವೆ.
ಕಿಣ್ವ-ಸಂಯೋಜಿತ ಇಮ್ಯುನೊಸೋರ್ಬೆಂಟ್ ಅಸ್ಸೇ (ELISA) ಡೇಟಾವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ವಿಸ್ತರಿಸಲು, ನಾವು LukAB ನ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಕೀ ಚೈಮೆರಾಗಳೊಂದಿಗೆ (ಟೇಬಲ್ 1) ಅಳೆಯಲು ಮೇಲ್ಮೈ ಪ್ಲಾಸ್ಮನ್ ರೆಸೋನೆನ್ಸ್ (SPR) ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ನ ವಿಘಟನೆಯ ಸ್ಥಿರಾಂಕ (KD) 39.29 nM ಆಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೆ ಮೌಸ್ I ಡೊಮೇನ್‌ನ KD 246.6 μM ನಲ್ಲಿ 6000 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ. ನಮ್ಮ ಸಂಯೋಜಿತ ಚೈಮೆರಾ MHM 7 ನ KD 69.60 nM ಆಗಿದೆ, ಇದು ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಿಂತ 1.7 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ. ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, MHM 7292-295 ನ KD 173.98 nm ಆಗಿದೆ, ಇದು ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಿಂತ 4.4 ಪಟ್ಟು ದೊಡ್ಡದಾಗಿದೆ, ಇದು MHM 7 ಚೈಮೆರಾದಲ್ಲಿನ 292-295 ಲೂಪ್ ಅನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ಉಳಿದವುಗಳು ಸಹ ಟಾಕ್ಸಿನ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗೆ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಮೇಲಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು 289 ರಿಂದ 316 ರವರೆಗಿನ ಮಾನವ ಅವಶೇಷಗಳು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಮುರಿನ್ I ಡೊಮೇನ್ ಅನ್ನು LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವಂತೆ ಮಾಡಲು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಗುರುತಿಸಿದೆ. ಮುಂದೆ, ಮಾನವನ 289 ರಿಂದ 316 ಶೇಷಗಳನ್ನು ಪೂರ್ಣ ಉದ್ದಕ್ಕೆ ಪರಿಚಯಿಸುವುದು, ಮೇಲ್ಮೈ-ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದ ಮ್ಯೂರಿನ್ CD11b ರಿಸೆಪ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಟಾಕ್ಸಿನ್ ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆಯೇ ಎಂದು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಬಯಸುತ್ತೇವೆ. ಸಂಪೂರ್ಣ ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್ ಅಥವಾ MHM 7 ಚಿಮೆರಿಕ್ I ಡೊಮೇನ್ ಮತ್ತು ಮ್ಯೂರಿನ್ CD18 (ಚಿತ್ರ S2C) ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ ಮ್ಯೂರಿನ್ CD11b ಅನ್ನು ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡಲು ಮಾನವ ಭ್ರೂಣದ ಮೂತ್ರಪಿಂಡ (HEK) 293T ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ವರ್ಗಾಯಿಸಲು ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಮಾನವನ CD11b/CD18 ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಕೋಶವನ್ನು ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವಂತೆ ಮಾಡಿದ್ದರೂ, ಮ್ಯೂರಿನ್ CD11b/CD18 ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಸಂಪೂರ್ಣ ಕೋಶ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯೀಕರಿಸಿತು. WT ಹ್ಯೂಮನ್ I ಡೊಮೇನ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ ಅಥವಾ MHM 7 (ಚಿತ್ರ 3G) ನಲ್ಲಿನ 11 ಮಾನವ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮಾನವೀಕರಿಸಿದ ಮ್ಯೂರಿನ್ CD11b ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗೆ LukAB ಬಂಧಿಸಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಮಾನವೀಕರಿಸಿದ ಮುರೈನ್ CD11b ನಲ್ಲಿರುವ LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಡೊಮೇನ್ ಹೋಸ್ಟ್ ಸೆಲ್ ಅನ್ನು LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವಂತೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.
MHM 7 ಚೈಮೆರಾದಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾದ LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿನ ಗಮನಾರ್ಹ ಹೆಚ್ಚಳವು ಈ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಮಾನವೀಕರಿಸಬಹುದೇ ಎಂದು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು ನಮ್ಮನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು. ಮುರೈನ್ ಇಟ್ಗಮ್ 55,852 ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಟೈಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು 30 ಎಕ್ಸಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ದೊಡ್ಡ ಜೀನ್ ಆಗಿದೆ. ಅದೃಷ್ಟವಶಾತ್, LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ ಇಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಪ್ರದೇಶವು ಎಕ್ಸಾನ್ 9 ರಿಂದ ಎನ್‌ಕೋಡ್ ಆಗಿದೆ. ನಾವು ಎಕ್ಸಾನ್ 9 ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ ಮಾನವ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು 289 ರಿಂದ 316 (ಚಿತ್ರ 4A ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S3A) ಸಂಪಾದಿಸಲು CRISPR-Cas9 (28) ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. "ಮಾನವೀಕರಿಸಿದ CD11b" ಇಲಿಗಳನ್ನು (hCD11b ಇಲಿಗಳು) ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ನೋಟ, ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಸಾಮರ್ಥ್ಯ, ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯತೆ ಮತ್ತು ಆರೋಗ್ಯ ಸ್ಥಿತಿಯು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಕೊಂಡರು.
(A) ಎಕ್ಸಾನ್ 9 ಅನ್ನು ಮಾನವೀಕರಿಸಲು ಬಳಸಲಾದ ಮ್ಯೂರಿನ್ ಇಟ್‌ಗಾಮ್ ಲೋಕಸ್ ಮತ್ತು DNA ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ. (B to D) CD11b, F4/80 ಮತ್ತು MHC II iBMDM ಗಳಿಂದ WT ಮತ್ತು hCD11b ಇಲಿಗಳು ಫ್ಲೋ ಸೈಟೊಮೆಟ್ರಿ (B) ಮೂಲಕ ಬಣ್ಣ ಮತ್ತು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲ್ಪಟ್ಟವು. (C) WT ಮತ್ತು hCD11b iBMDM ಅನ್ನು GFP-ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ± ಸೀರಮ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವು ನೀಡಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಫಾಗೊಸೈಟೋಸಿಸ್ ಅನ್ನು GFP-ಧನಾತ್ಮಕ iBMDM ಗಳ% ನಂತೆ ಫ್ಲೋ ಸೈಟೊಮೆಟ್ರಿಯಿಂದ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿಕೃತಿ ± SEM ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಿದ ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಸರಾಸರಿಯಂತೆ ಡೇಟಾವನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (D ಮತ್ತು E) WT ಮತ್ತು hCD11b iBMDM (D) ಮತ್ತು ಪೆರಿಟೋನಿಯಲ್ ಎಕ್ಸೂಡೇಟಿವ್ ಕೋಶಗಳು (E) ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ LukAB ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲ್ಪಟ್ಟವು, ಮತ್ತು ಬೌಂಡ್ LukAB ಅನ್ನು ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿಯಿಂದ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರತಿಕೃತಿ ± SEM ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಿದ ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಸರಾಸರಿಯಂತೆ ಡೇಟಾವನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಎರಡು-ಮಾರ್ಗದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ಮಹತ್ವವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (**** P ಈ ಇಲಿಗಳನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು, ನಾವು ಮೊದಲು hCD11b ಮತ್ತು WT ಇಲಿಗಳಿಂದ ಮೂಳೆ ಮಜ್ಜೆಯ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕೊಯ್ಲು ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಅಮರವಾದ ಮೂಳೆ ಮಜ್ಜೆಯಿಂದ ಪಡೆದ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಫೇಜ್‌ಗಳನ್ನು (iBMDM) ಉತ್ಪಾದಿಸಿದ್ದೇವೆ (29). WT ಮತ್ತು hCD11b ಇಲಿಗಳಿಂದ iBMDM ಒಂದೇ ಮಟ್ಟದ CD11b, F4/80, ಮತ್ತು ಮೇಜರ್ ಹಿಸ್ಟೋಕಾಂಪ್ಯಾಬಿಲಿಟಿ ಕಾಂಪ್ಲೆಕ್ಸ್ (MHC) ವರ್ಗ II ಅನ್ನು ಅವುಗಳ ಮೇಲ್ಮೈಗಳಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ 4B) ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ. ಇದರ ಜೊತೆಯಲ್ಲಿ, hCD11b ಜೀವಕೋಶಗಳು ಫಾಗೊಸೈಟೋಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಸೀರಮ್‌ನ ಫಾಗೊಸೈಟೋಸಿಸ್ ಎರಡರಲ್ಲೂ ಹಸಿರು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ (GFP) ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಅನ್ನು ಫಾಗೊಸೈಟೋಸ್ ಮಾಡಬಹುದು, ಇದು ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ WT (ಚಿತ್ರ 4C) ಯಂತೆಯೇ ಇರುತ್ತದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, hCD11b ಇಲಿಗಳು CD11b- ಅವಲಂಬಿತ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಅಥವಾ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಟ್ಟವನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಬದಲಾಯಿಸುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ತೋರುತ್ತದೆ.
ಮುಂದೆ, WT ಮತ್ತು hCD11b ಇಲಿಗಳಿಂದ iBMDM ಗೆ LukAB ಅನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಯಿತು. HEK293T ಸಂಪೂರ್ಣ ಕೋಶ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಅಧ್ಯಯನಕ್ಕೆ (ಚಿತ್ರ 3G) ಅನುಗುಣವಾಗಿ, LukAB hCD11b-ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ಮೌಸ್ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೆ WT ಮೌಸ್ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ದುರ್ಬಲವಾಗಿ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 4D). ಈ ಡೇಟಾವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಲು, ನಾವು ಸಂಪೂರ್ಣ ಸೆಲ್ SPR ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು LukAB ಮತ್ತು murine iBMDM ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅಳತೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ. hCD11b ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ iBMDM ಗೆ ಸಂಬಂಧವು 187.7 nM ನ KD ಯೊಂದಿಗೆ iBMDM ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ WT CD11b ಗಿಂತ 13 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ S3B).
ಮುಂದೆ, ನಾವು ಹೊಸದಾಗಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಮೌಸ್ ಪೆರಿಟೋನಿಯಲ್ ಎಕ್ಸೂಡೇಟ್ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇತರ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ. WT ಇಲಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, hCD11b ಇಲಿಗಳಿಂದ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಸುಧಾರಿತ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 4E). ಹೆಚ್ಚಿದ LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್ ನೇರವಾಗಿ ಟಾಕ್ಸಿನ್-ಮಧ್ಯವರ್ತಿ hCD11b ಪೆರಿಟೋನಿಯಲ್ ಎಕ್ಸ್ಯುಡೇಟಿವ್ ಸೆಲ್ ಮೆಂಬರೇನ್ ಹಾನಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಎಂದು ಗಮನಿಸಬೇಕಾದ ಅಂಶವಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 4F). ಪೆರಿಟೋನಿಯಲ್ ಹೊರಸೂಸುವ ಕೋಶಗಳು CD11b ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ವಿವಿಧ ಬಿಳಿ ರಕ್ತ ಕಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ, ಇದರಲ್ಲಿ ಪಾಲಿಮಾರ್ಫೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ನ್ಯೂಟ್ರೋಫಿಲ್‌ಗಳು (PMN), ಮ್ಯಾಕ್ರೋಫೇಜಸ್, ಮೊನೊಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಡೆಂಡ್ರಿಟಿಕ್ ಕೋಶಗಳು (DC) ಸೇರಿವೆ. LukAB ನ ಗುರಿಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು, ನಾವು hCD11b ಇಲಿಗಳಿಂದ ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಮುರಿನ್ ಪೆರಿಟೋನಿಯಲ್ ಸ್ರವಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಟಾಕ್ಸಿನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಬಹು-ಪ್ಯಾರಾಮೀಟರ್ ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಅಧ್ಯಯನಗಳು PMN ಲ್ಯುಕೋಸೈಟ್ ಆಗಿದ್ದು ಅದು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ LukAB-ಮಧ್ಯಸ್ಥ ಪೊರೆಯ ಹಾನಿಗೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ ಮೊನೊಸೈಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು DC (ಚಿತ್ರ 4G).
ಮುಂದೆ, hCD11b ಇಲಿಗಳು ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಸೋಂಕಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಒಳಗಾಗುತ್ತವೆಯೇ ಎಂದು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ. ನಾವು MRSA ಸ್ಟ್ರೈನ್ LAC (ಲಾಸ್ ಏಂಜಲೀಸ್ ಕೌಂಟಿ) ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು USA300 ಪ್ರಕಾರದ ಪಲ್ಸ್ ಫೀಲ್ಡ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್‌ನ ಪ್ರತಿನಿಧಿಯಾಗಿದೆ. ಇದು ಸಮುದಾಯ-ಸ್ವಾಧೀನಪಡಿಸಿಕೊಂಡಿರುವ MRSA ಸೋಂಕುಗಳಿಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯ ಕಾರಣವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಯುನೈಟೆಡ್ ಸ್ಟೇಟ್ಸ್‌ನ ಆಸ್ಪತ್ರೆಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ MRSA ಸೋಂಕುಗಳ ಉದಯೋನ್ಮುಖ ಕಾರಣವಾಗಿದೆ. ರಾಜ್ಯ (30). ವಯಸ್ಸಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವ WT ಮತ್ತು hCD11b ಇಲಿಗಳು USA300 ರೆಟ್ರೊ-ಆರ್ಬಿಟಲಿ 3×106 ಕಾಲೋನಿ ರೂಪಿಸುವ ಘಟಕಗಳಿಂದ (CFU) ಸೋಂಕಿಗೆ ಒಳಗಾಗಿದ್ದವು ಮತ್ತು ಸೋಂಕಿನ 3 ದಿನಗಳ ನಂತರ ಅಂಗಗಳಲ್ಲಿನ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೊರೆ ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಈ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ, ಕೇವಲ 30% WT ಇಲಿಗಳು ಯಕೃತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಬಹುದಾದ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೊರೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿವೆ. ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, hCD11b ಇಲಿಗಳು 86% ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಬಹುದಾದ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೊರೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ, ಇದು LukAB ಫಿನೋಟೈಪ್ (ಚಿತ್ರ 5A) ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, CD11b ನ ಮಾನವೀಕರಣವು WT ಇಲಿಗಳಿಂದ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಸೋಂಕಿನ ತಡೆಗೋಡೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಅಂಗಗಳಲ್ಲಿನ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೊರೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸುವ ಮೂಲಕ, WT ಇಲಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, hCD11b ಇಲಿಗಳ ಯಕೃತ್ತಿನಲ್ಲಿ CFU ಹೆಚ್ಚಳವು 1-ಲಾಗ್ (ಚಿತ್ರ 5B) ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಗುಲ್ಮ, ಮೂತ್ರಪಿಂಡಗಳು, ಹೃದಯ ಮತ್ತು ಶ್ವಾಸಕೋಶದ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೊರೆಯಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ತೂಕ ನಷ್ಟ ಅಥವಾ ಬದುಕುಳಿಯುವಿಕೆಯ ದರಗಳಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳಿಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ S4, A ಮತ್ತು B). hCD11b ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಹೆಚ್ಚಿದ CFU ಫಿನೋಟೈಪ್ ಕೂಡ LukAB ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ΔlukABUSA300 ಫಿನೋಟೈಪ್ ಸೋಂಕಿತ WT ಇಲಿಗಳು WT USA300 ಮತ್ತು hCD11b ಇಲಿಗಳಿಂದ ಸೋಂಕಿಗೆ ಒಳಗಾಗಿದ್ದವು (ಚಿತ್ರ 5B).
(A ಮತ್ತು B) WT USA300 ಸ್ಟ್ರೈನ್ LAC ಅಥವಾ ಸಿಂಜೆನಿಕ್ ಡೆಲುಕಾಬ್ಲಾಕ್ ಸ್ಟ್ರೈನ್ ~3×106 CFU ನೊಂದಿಗೆ WT ಮತ್ತು hCD11b ಇಲಿಗಳನ್ನು ಅಭಿದಮನಿ ಮೂಲಕ ಸೋಂಕು ತಗುಲಿಸುತ್ತದೆ. ಸೋಂಕಿನ ಮೂರು ದಿನಗಳ ನಂತರ, ಯಕೃತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆ ಮಾಡಬಹುದಾದ CFU ಹೊಂದಿರುವ ಇಲಿಗಳ ಶೇಕಡಾವಾರು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗಿದೆ (A). ಚಿ-ಸ್ಕ್ವೇರ್ ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (** P ಮುಂದೆ, ನಾವು ΔlukABUSA300 ನ 1×107 CFU ಅಥವಾ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ನಲ್ಲಿ lukAB ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಐಸೊಜೆನಿಕ್ ಸ್ಟ್ರೈನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಇಲಿಗಳನ್ನು ಸೋಂಕಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪೂರಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳನ್ನು ನಡೆಸಿದ್ದೇವೆ. ಪೂರಕ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗಳ ನಷ್ಟವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಸೋಂಕಿನ 1 ದಿನದ ನಂತರ ಅಂಗಗಳನ್ನು ಕೊಯ್ಲು ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಈ ಅಧ್ಯಯನಗಳು hCD11b ಇಲಿಗಳ ಯಕೃತ್ತಿನ CFU ಲುಕಾಬಿ-ಅವಲಂಬಿತ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿದೆ ಎಂದು ಸಾಬೀತುಪಡಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5C). ಆದ್ದರಿಂದ, ಮಾನವೀಕರಿಸಿದ CD11b LukAB ಅನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುವ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ MRSA ರಕ್ತದ ಸೋಂಕಿಗೆ ಇಲಿಗಳ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.
ಯಕೃತ್ತು-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೊರೆಯಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಹೆಚ್ಚಳವು ದೇಹದಲ್ಲಿನ ಲುಕಾಬಿಯ ವಿಭಿನ್ನ ನಿಯಂತ್ರಣ/ಉತ್ಪಾದನೆಯ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿರಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಸಮಸ್ಯೆಯನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲು, ದೇಹದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ LukAB ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು ನಾವು ELISA ಅನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಸೋಂಕಿನ ಒಂದು ದಿನದ ನಂತರ, ನಾವು ಯಕೃತ್ತು ಮತ್ತು ಮೂತ್ರಪಿಂಡಗಳಲ್ಲಿ LukAB ಮಟ್ಟವನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೊರೆ ಹೋಲಿಸಬಹುದಾದರೂ (ಚಿತ್ರ 5D), ನಾವು ಸೋಂಕಿತ ಇಲಿಗಳ ಯಕೃತ್ತಿನಲ್ಲಿ LukAB ಅನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು ಆದರೆ ಮೂತ್ರಪಿಂಡಗಳಲ್ಲಿ ಅಲ್ಲ (ಚಿತ್ರ 5E ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S4, C ಮತ್ತು D). ಆದ್ದರಿಂದ, ಇತರ ಅಂಗಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, LukAB ಯಕೃತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ರಕ್ತದ ಸೋಂಕಿನ ನಂತರ ಸೋಂಕಿತ ಮೊದಲ ಅಂಗಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದಾಗಿದೆ (31), ಇದು ಯಕೃತ್ತು-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ LukAB ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೊರೆ ಹೆಚ್ಚಳಕ್ಕೆ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತದೆ. ಸಂಭವನೀಯ ವಿವರಣೆಗಳು.
ಅಂಗಾಂಶ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಫಿನೋಟೈಪ್ ಅನ್ನು ನೇಮಕಾತಿ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಸ್ಥಳೀಯ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಒಳಗಾಗುವ ಜೀವಕೋಶಗಳ ಮೂಲಕ ವಿವರಿಸಬಹುದು. PMN ಲುಕಾಬಿ ಸೋಂಕಿಗೆ ಒಳಗಾಗುವ ಮುಖ್ಯ hCD11b ಸೆಲ್ ಪ್ರಕಾರವಾಗಿರುವುದರಿಂದ (ಚಿತ್ರ 4G), ನಾವು ಸೋಂಕಿನ 1 ದಿನದ ನಂತರ ಸೋಂಕಿತವಲ್ಲದ ನಿಯಂತ್ರಣ ಇಲಿಗಳ ಯಕೃತ್ತು ಮತ್ತು ಮೂತ್ರಪಿಂಡದಲ್ಲಿ PMN ಅನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಸೋಂಕಿಗೆ ಒಳಗಾಗದ ಯಕೃತ್ತಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಸೋಂಕಿತ ಯಕೃತ್ತಿನ ಸೋಂಕಿತ ಯಕೃತ್ತಿನ ಪ್ರಮಾಣವು ಸೋಂಕಿನ 1 ದಿನದ ನಂತರ 10 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಮೂತ್ರಪಿಂಡಗಳಲ್ಲಿನ PMN ಗಳು ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಇನ್ನೂ ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5F ಮತ್ತು ಚಿತ್ರ S4). ಒಟ್ಟಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಂಡರೆ, ಈ ಡೇಟಾವು ಸೋಂಕಿನ ನಂತರ ಆರಂಭಿಕ ಯಕೃತ್ತಿನಲ್ಲಿ LukAB ಮತ್ತು LukAB ನಿಂದ ಗುರಿಪಡಿಸಿದ ಜೀವಕೋಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯು ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಅಂಗಾಂಶ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ LukAB- ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೊರೆಯ ಹೆಚ್ಚಳಕ್ಕೆ ವಿವರಣೆಯನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ.
ಇಲ್ಲಿ, ನಾವು LukAB ಟಾಕ್ಸಿನ್‌ಗಳಿಂದ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾದ ಜಾತಿ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಆಣ್ವಿಕ ನಿರ್ಣಾಯಕಗಳನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಸೋಂಕಿನ ಸುಧಾರಿತ ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಲು ಈ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. LukAB ಮಾನವನ CD11b I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಹೇಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಆದರೆ ಮೌಸ್ I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಹೇಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಮೊದಲು ವ್ಯಾಪಕವಾದ ವಿಕಸನೀಯ ಆನುವಂಶಿಕ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅಳವಡಿಸಿಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಪ್ರೈಮೇಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ದಂಶಕಗಳ ನಡುವೆ ಕಂಡುಬರುವ ಗಣನೀಯ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ. . CD11b ನಲ್ಲಿನ ಬಹು ಸೈಟ್‌ಗಳು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ I ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ, ಸಾರ್ವತ್ರಿಕ ಧನಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಿರುವುದನ್ನು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಸೈಟ್‌ಗಳು ಬಲವಾದ ಮತ್ತು ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಆಯ್ದ ಒತ್ತಡದಲ್ಲಿವೆ ಎಂದು ಇದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಪರ್ಯಾಯಕ್ಕೆ ಅನುಕೂಲಕರವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ರೋಗಕಾರಕಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಈ ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು ಸರಿಸುಮಾರು 40 ಮಿಲಿಯನ್ ವರ್ಷಗಳ ಪ್ರೈಮೇಟ್ ಡೈವರ್ಜೆನ್ಸ್‌ನಿಂದ ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ನಮ್ಮ ದಂಶಕಗಳ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ ವಿಕಸನದ ಮಧ್ಯಂತರಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದರಿಂದ, ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರಾಚೀನ ರೋಗಕಾರಕಗಳ ಆಯ್ಕೆಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು ಅವಶ್ಯಕ. ಆದಾಗ್ಯೂ, I-ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಆಯ್ಕೆ ಸೈಟ್‌ಗಳು LukAB-ತರಹದ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಎನ್‌ಕೋಡಿಂಗ್ ರೋಗಕಾರಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಸಂವಹನಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತವೆ. ಹಿಂದಿನ ವಿಕಸನೀಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯಿಂದಾಗಿ, ಈ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಆಯ್ಕೆಗಳು ಆಧುನಿಕ ಜಾತಿಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ನಿರೋಧಕ ಅಥವಾ ಸಮಕಾಲೀನ ಸೋಂಕುಗಳಿಗೆ ಒಳಗಾಗುವಂತೆ ಮಾಡಬಹುದು. I ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿನ ಈ ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿ, ನಾವು 294 (E294) ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಗ್ಲುಟಾಮಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ. ದಂಶಕಗಳಲ್ಲಿರುವ ಈ ಸೈಟ್‌ನಲ್ಲಿನ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ಪರಿಶೀಲಿಸುವ ಮೂಲಕ, ಓರ್ಡ್‌ನ ಕಾಂಗರೂ ಇಲಿ I ಡೊಮೇನ್ LukAB ನೊಂದಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೂ ಮಾನವ I ಡೊಮೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಅದರ ಒಟ್ಟಾರೆ ಹೋಮಾಲಜಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ. ಇದು 294 ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿರುವ ಗ್ಲುಟಾಮಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ಸುತ್ತಮುತ್ತಲಿನ ಲೂಪ್‌ನಿಂದಾಗಿ ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸುತ್ತೇವೆ, ಇದು ಮಾನವರೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಅತಿಕ್ರಮಿಸುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, E294 LukAB ಬೈಂಡಿಂಗ್‌ಗೆ ಮಾತ್ರ ಜವಾಬ್ದಾರನಾಗಿರುವುದಿಲ್ಲ. I-ಡೊಮೈನ್ ಚೈಮೆರಾಗಳ ಸರಣಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ನಾವು 11 ವಿಭಿನ್ನ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಬಂಧಿಸಲು ಅವಶ್ಯಕವಾಗಿದೆ. ಈ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಮಾನವ ಅನುಕ್ರಮದೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸುವುದರಿಂದ ಮೌಸ್ CD11b ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ-ಸಂಬಂಧ LukAB ಬಂಧಕವಾಗಿದೆ.
ಮ್ಯೂರಿನ್ CD11b ಗೆ LukAB ಯ ದುರ್ಬಲ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯಿಂದಾಗಿ, ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಸೋಂಕಿಗೆ ಈ ವಿಷದ ಕೊಡುಗೆಯನ್ನು ಪ್ರಸ್ತುತ ಮ್ಯೂರಿನ್ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಅಂದಾಜು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಈ ದೋಷವನ್ನು ಪರಿಹರಿಸಲು, ನಾವು ಮ್ಯೂರಿನ್ CD11b ಗ್ರಾಹಕವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಇಲಿಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು 11 ಮಾನವ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು LukAB ಗೆ ಮಾನವನ CD11b I ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸಲು ಅವಶ್ಯಕವಾಗಿದೆ. hCD11b ಇಲಿಗಳು ಅಡೆತಡೆಯಿಲ್ಲದ CD11b ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವಂತೆ ತೋರುತ್ತಿದೆ, ಇದು ನಾವು ರೂಪಾಂತರಿಸಿದ ಪ್ರದೇಶವು ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಡೊಮೇನ್ ಇತರ CD11b ಲಿಗಾಂಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸುವಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿಲ್ಲ ಎಂಬ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿರಬಹುದು. ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಈ ಇಲಿಗಳು MRSA ಸೋಂಕಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಒಳಗಾಗುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಡೇಟಾ ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. WT USA300 ನಿಂದ WT ಇಲಿಗಳಿಗೆ ಸೋಂಕು ΔlukAB USA300 ನಿಂದ hCD11b ಇಲಿಗಳ ಫಿನೋಟೈಪಿಕ್ ಸೋಂಕು ಇಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದ ಹೆಚ್ಚಿದ ಸಂವೇದನೆಯು LukAB ನಿಂದ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು hCD11b ಇಲಿಗಳು LukAB ತಳಿಗಳ ಕೊರತೆಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಒಳಗಾಗುವುದಿಲ್ಲ. ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಸೋಂಕಿನ ಪರಿಣಾಮಗಳು.
ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಸೋಂಕಿನ 1 ದಿನದ ನಂತರ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೊರೆಯ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ಮೂತ್ರಪಿಂಡಕ್ಕೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಯಕೃತ್ತಿನಲ್ಲಿ LukAB ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಜೊತೆಗೆ, hCD11b ಇಲಿಗಳಲ್ಲಿ, PMN, LukAB ಗೆ ಒಳಗಾಗುವ ಮುಖ್ಯ ಫಾಗೊಸೈಟಿಕ್ ಕೋಶ, ಸೋಂಕಿನ 1 ದಿನದ ನಂತರ ಯಕೃತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಗಣನೀಯವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾಯಿತು, ಆದರೆ ಸೋಂಕಿತ ಮೂತ್ರಪಿಂಡದಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಉಳಿದಿದೆ. ಹೆಚ್ಚಿನ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಹೊರೆಯ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ದೊಡ್ಡ PMN ಒಳನುಸುಳುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಮೂತ್ರಪಿಂಡದ ಬಾವು ರಚನೆಯು ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಸೋಂಕಿನ 3 ದಿನಗಳ ನಂತರ ಮೊದಲ ಬಾರಿಗೆ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುವ ಅಧ್ಯಯನಗಳಿಗೆ ಈ ಸಂಶೋಧನೆಗಳು ಪೂರಕವಾಗಿವೆ (32). ಇದಕ್ಕೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ, ಯಕೃತ್ತು ಇಂಟ್ರಾವೆನಸ್ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಸೋಂಕುಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸೋಂಕಿನ ನಂತರ, ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಯಕೃತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಕುಪ್ಫರ್ ಕೋಶಗಳಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಪೂಲ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ (31). ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವು ತಪ್ಪಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಇತರ ಅಂಗಗಳಿಗೆ ಹರಡುತ್ತದೆ, ಅಥವಾ ಸೋಂಕನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ. ಒಟ್ಟಾಗಿ, ನಾವು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಯಕೃತ್ತಿನಲ್ಲಿ ಲುಕಾಬ್-ಅವಲಂಬಿತ ಫಿನೋಟೈಪ್‌ಗಳನ್ನು ಏಕೆ ವೀಕ್ಷಿಸುತ್ತೇವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಇದು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಮೂತ್ರಪಿಂಡಗಳಂತಹ ಇತರ ಅಂಗಗಳಲ್ಲಿ ಅಲ್ಲ. ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, PMN ಗಳ ಮೇಲಿನ CD11b ಅನ್ನು ಅಪ್-ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗಿದೆ (33), ಆದರೆ PMN ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, LukAB ಅನ್ನು ಅಪ್-ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗಿದೆ (34). ಆದ್ದರಿಂದ, ಅತಿಥೇಯವು ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಟ್ಟದ CD11b ನೊಂದಿಗೆ PMN ಅನ್ನು ನೇಮಕ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಉಪಸ್ಥಿತಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವು ಈ ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗೆ ಹಾನಿ ಮಾಡಲು LukAB ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ಮೂಲಕ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.
ಇಲ್ಲಿ, ನಾವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ರಕ್ತದ ಸೋಂಕಿನ ಮಾದರಿಯನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತೇವೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ವಿವಿಧ ರೀತಿಯ ಕಾಯಿಲೆಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಲುಕಾಬಿ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಇತರ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ನಿರೂಪಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ (ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಚರ್ಮದ ಸೋಂಕುಗಳು, ನ್ಯುಮೋನಿಯಾ, ಆಸ್ಟಿಯೋಮೈಲಿಟಿಸ್, ಸಾಧನ-ಸಂಬಂಧಿತ ಸೋಂಕುಗಳು, ಇತ್ಯಾದಿ). ಭವಿಷ್ಯದಲ್ಲಿ, ಈ ಯಕೃತ್ತಿನ ಫಿನೋಟೈಪ್ ಸೋಂಕಿನ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಆಸಕ್ತಿದಾಯಕವಾಗಿದೆ.
ಮಾನವ ಉಷ್ಣವಲಯವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವ ಅನೇಕ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ವೈರಲೆನ್ಸ್ ಅಂಶಗಳಲ್ಲಿ LukAB ಒಂದಾಗಿದೆ. ಜೀವರಸಾಯನಶಾಸ್ತ್ರ ಮತ್ತು ಜೆನೆಟಿಕ್ ಇಂಜಿನಿಯರಿಂಗ್‌ನೊಂದಿಗಿನ ವಿಕಸನೀಯ ಸಂಶೋಧನೆಯ ಸಂಯೋಜನೆಯು ಜಾತಿ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಹೋಸ್ಟ್-ರೋಗಕಾರಕ ಸಂವಹನಗಳ ವಿವೋ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ ಹೇಗೆ ಸುಗಮಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಮಾರ್ಗಸೂಚಿಯನ್ನು ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ. ಮಾನವೀಯಗೊಳಿಸುವ ಅಥವಾ ಮಾನವ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಗುರಿಗಳನ್ನು ನಾಕ್ಔಟ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ, ಮಾನವ ಸೋಂಕುಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ನಿಕಟವಾಗಿ ಅನುಕರಿಸುವ ಸುಧಾರಿತ ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಇದು ಕಾರ್ಯಸಾಧ್ಯವಾಗಿರಬೇಕು. ಈ ಮಾದರಿಗಳು ವಿರೋಧಿ ಎಸ್ ಸಂಶೋಧನೆಯ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯನ್ನು ಹಿಂದೆ ಪರೀಕ್ಷಿಸದ ವೈರಲೆನ್ಸ್ ಅಂಶಗಳಿಗಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ, ಹೆಚ್ಚು ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಆಂಟಿ-ಎಸ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಸೂಕ್ತವಾದ ಗುರಿಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ನಮ್ಮ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ. ಗೋಲ್ಡನ್ ಹಳದಿ ಏಜೆಂಟ್.
ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡ ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನ್ಯೂಯಾರ್ಕ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾಲಯದ ಸಾಂಸ್ಥಿಕ ಪ್ರಾಣಿಗಳ ಆರೈಕೆ ಮತ್ತು ಬಳಕೆಯ ಸಮಿತಿಯು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ಅನುಮೋದಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ನ್ಯಾಷನಲ್ ಇನ್‌ಸ್ಟಿಟ್ಯೂಟ್ ಆಫ್ ಹೆಲ್ತ್ (NIH), ಅನಿಮಲ್ ವೆಲ್‌ಫೇರ್ ಆಕ್ಟ್ ಮತ್ತು ಯುನೈಟೆಡ್ ಸ್ಟೇಟ್ಸ್ ಫೆಡರಲ್ ಕಾನೂನಿನ ಮಾರ್ಗದರ್ಶನಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
E. coli DH5a ಅನ್ನು ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ. E. coli T7 LysY / LacQ ಅನ್ನು ಮಾನವ FLAG ಟ್ಯಾಗ್‌ಗಳ CD11b I ಡೊಮೇನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಎಲ್ಲಾ E. ಕೋಲಿ ತಳಿಗಳನ್ನು ಲೂರಿಯಾ-ಬರ್ಟಾನಿ (LB) ಸಾರುಗಳಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ತಳಿಗಳನ್ನು ಟೇಬಲ್ S4 ನಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಮರುಸಂಯೋಜಿತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮತ್ತು ಸೋಂಕಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳಿಗಾಗಿ, ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ತಳಿಗಳನ್ನು ಟ್ರಿಪ್ಟಿಕ್ ಸೋಯಾ ಅಗರ್ (TSA) ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದೇ ವಸಾಹತುಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ಒಂದೇ ವಸಾಹತುವನ್ನು ಟ್ರಿಪ್ಟಿಕ್ ಸೋಯಾ ಸಾರು (TSB) ನಲ್ಲಿ ಚುಚ್ಚುಮದ್ದು ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ 3 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 1:100 ಕ್ಕೆ TSB ನಲ್ಲಿ ಉಪಸಂಸ್ಕೃತಿ ಮಾಡಲಾಯಿತು.
ನಾನು ಮಾನವ ITGAM (NM_001145808.1) ಮತ್ತು ಮುರಿನ್ ಇಟ್‌ಗಾಮ್ (NM_001082960.1), ಹಾಗೆಯೇ 5′Nde I ಸೈಟ್, 3'6-ಗ್ಲೈಸಿನ್ ಲಿಂಕರ್, 3'3×FLAG ಟ್ಯಾಗ್, 3′Xho I ಸೈಟ್‌ಗಳು ಇಂಟಿಗ್ರೇಟೆಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನದಿಂದ (ಐಡಿಟಿ) ಜೀನ್ ತುಣುಕು ಅಗತ್ಯವಾದ ರೂಪಾಂತರಗಳನ್ನು (ಟೇಬಲ್ ಎಸ್ 6) ಉತ್ಪಾದಿಸಿತು ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪಿಇಟಿ 15 ಬಿ ಗೆ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಿತು. ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ (12), ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಅನ್ನು E. coli T7 LysY/LacQ ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಸ್ಟ್ರೈನ್ ಅನ್ನು ಆಂಪಿಸಿಲಿನ್ (100μg/ml) ಜೊತೆಗೆ 37 ° C ಮತ್ತು 180 rpm ನೊಂದಿಗೆ 0.5 ನ OD600 (600 nm ನಲ್ಲಿ ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಸಾಂದ್ರತೆ) ಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿ LB ಸಾರುಗಳಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ 1 mM ಐಸೊಪ್ರೊಪಿಲ್-1-β-ಡ್ರಾಪ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. 3 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಥಿಯೋಗಲಾಕ್ಟೋಪಿರಾನೋಸೈಡ್ ಇಂಡಕ್ಷನ್ (IPTG). ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು 3 U/ml ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್ (ರೋಚೆ), ಲೈಸೋಜೈಮ್ (1 mg/ml) ಮತ್ತು ಬೆಂಜೊಯಿಕ್ ನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ (ಸಿಗ್ಮಾ) ಜೊತೆಗೆ xTracter ಬಫರ್ (Clontech) ನೊಂದಿಗೆ ಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ನಿಕಲ್-ಟ್ರಿಫ್ಲೋರೋಟ್ರಿಯಾಸೆಟಿಕ್ ಆಸಿಡ್ (NTA) ರಾಳ (ಕಿಯಾಜೆನ್) ನೊಂದಿಗೆ ಲೈಸೇಟ್ ಅನ್ನು ಕಾವು ಮಾಡಿ, ತೊಳೆಯಿರಿ ಮತ್ತು ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಟ್ಯಾಗ್ ಸೇರಿಸಿ. I-ಡೊಮೇನ್ ಅನ್ನು 500 mM ಇಮಿಡಾಜೋಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹೊರಹಾಕಲಾಗಿದೆ. ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು 1x ಟ್ರಿಸ್ ಬಫರ್ಡ್ ಸಲೈನ್ (TBS) + 10% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್‌ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಡಯಾಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ -80 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಮೇಲೆ ಹೇಳಿದಂತೆ (34), 5'6x-ಹಿಸ್ಟಿಡಿನ್ ಟ್ಯಾಗ್ನೊಂದಿಗೆ ಲುಕಾಬಿಯನ್ನು ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ (ಟೇಬಲ್ S4) ನಿಂದ ಸಹ-ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, OD600 ಸುಮಾರು 1.5 ಆಗುವವರೆಗೆ (1×109 CFU/ml ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ) 5 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 37 ° C ಮತ್ತು 180 rpm ನಲ್ಲಿ ಕ್ಲೋರಂಫೆನಿಕೋಲ್ (10μg/ml) ಹೊಂದಿರುವ TSB ನಲ್ಲಿ ಸ್ಟ್ರೈನ್ ಅನ್ನು ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು ಅವಕ್ಷೇಪಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. NTA ರಾಳವನ್ನು (ಕಿಯಾಜೆನ್) ಕಲ್ಚರ್ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು, ತೊಳೆದು, 500 mM ಇಮಿಡಾಜೋಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಎಲಿಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ 1x TBS ಮತ್ತು 10% ಗ್ಲಿಸರಾಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಡಯಾಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ -80 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಮರುಸಂಯೋಜಕ I ಡೊಮೇನ್ (10 μg/ml) ಅನ್ನು ಇಮ್ಮುಲಾನ್ 2HB 96-ವೆಲ್ ಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಬಾವಿಗಳಲ್ಲಿ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್ಡ್ ಸಲೈನ್‌ನಲ್ಲಿ (PBS) ರಾತ್ರಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಲೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ. ಬಾವಿಗಳನ್ನು ಹೀರುವ ಬಫರ್ (2% ನಾನ್-ಫ್ಯಾಟ್ ಡ್ರೈ ಹಾಲು, 0.9% NaCl, 0.05% ಟ್ವೀನ್ 20, PBS) ನೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ, ಅಲುಗಾಡುವ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಹೀರುವ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ LukAB ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆದು ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ನಿಮಿಷಗಳು. ಬಾವಿಗಳನ್ನು ತೊಳೆದುಕೊಳ್ಳಿ ಮತ್ತು ಆಂಟಿ-ಲುಕಾ ಮೊಲದ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯದೊಂದಿಗೆ 1:3000 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ, ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಅಲುಗಾಡಿಸುವಿಕೆ. ಮುಂದೆ, ಬಾವಿಗಳನ್ನು ಅಲುಗಾಡುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ 1 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1: 2500 ರಷ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಮೊಲ-ವಿರೋಧಿ ಹಾರ್ಸ್ರಡೈಶ್ ಪೆರಾಕ್ಸಿಡೇಸ್ (HRP) ನೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆದು ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಬಾವಿಗಳನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ ಮತ್ತು 100 μl 3,3′,5,5′-ಟೆಟ್ರಾಮೆಥೈಲ್ಬೆನ್ಜಿಡಿನ್ (TMB) ತಲಾಧಾರದೊಂದಿಗೆ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಿ. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು 100 μl ಸಲ್ಫ್ಯೂರಿಕ್ ಆಮ್ಲದೊಂದಿಗೆ ಕೊನೆಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 450 nm ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
ನ್ಯಾಷನಲ್ ಸೆಂಟರ್ ಫಾರ್ ಬಯೋಟೆಕ್ನಾಲಜಿ ಮಾಹಿತಿ (NCBI) ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ನಿಂದ CD11b ನ ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ ಪೂರಕ DNA ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಹಿಂಪಡೆಯಲು BLAST ಹುಡುಕಾಟವನ್ನು ಬಳಸಿ. ಎಲ್ಲಾ DNA ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಜೋಡಿಸಲು MUSCLE ನ ಡೀಫಾಲ್ಟ್ ಸೆಟ್ಟಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ. ಎಲ್ಲಾ ಅಳವಡಿಕೆಗಳು, ಅಳಿಸುವಿಕೆಗಳು ಮತ್ತು ಸ್ಟಾಪ್ ಕೋಡಾನ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಹಸ್ತಚಾಲಿತವಾಗಿ ಟ್ರಿಮ್ ಮಾಡಿ. ವಿಕಸನೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಓರಣಗೊಳಿಸಿದ ಹೋಲಿಕೆ ಫೈಲ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ನಿರ್ಬಂಧಿತ ಜಾತಿಯ ಮರವನ್ನು ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಮಂಗಗಳು ಮತ್ತು ದಂಶಕಗಳ ನಡುವಿನ ಅತ್ಯಂತ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಅಂಗೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ವಿಕಸನೀಯ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತದೆ.
ದೊಡ್ಡ ಮಂಗಗಳು ಮತ್ತು ದಂಶಕಗಳ ವಿಕಸನೀಯ ಪ್ರಾಬಲ್ಯದ ಸಕಾರಾತ್ಮಕ ಆಯ್ಕೆ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಟ್ರಿಮ್ ಮಾಡಲಾದ ಜೋಡಣೆ ಫೈಲ್ ಮತ್ತು ಫೈಲೋಜೆನೆಟಿಕ್ ಟ್ರೀ ಅನ್ನು ಮೂರು ಪೂರಕ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್‌ಗಳಿಗೆ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಫೈಲ್‌ಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ: PAML (v4.8, M7 ಮತ್ತು M8) ಮತ್ತು ಹೈಫೈ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಪ್ಯಾಕೇಜ್ ಮೂಲಕ ಲಭ್ಯವಿರುವ MEME ಮತ್ತು FUBAR ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್‌ಗಳು. ಎಲ್ಲಾ ಮೂರು ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವಿರಳ ಮತ್ತು ಸಾರ್ವತ್ರಿಕ ವೈವಿಧ್ಯಮಯ ಆಯ್ಕೆ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವಂತೆ ಗುರುತಿಸಲಾದ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಿಗಾಗಿ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಅಭ್ಯರ್ಥಿಗಳೆಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಕೆಳಗಿನ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ: ಆಂಟಿ-ಲುಕಾ ಮೊಲದ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ (10), ಮೇಕೆ ವಿರೋಧಿ ಮೊಲದ ಇಮ್ಯುನೊಗ್ಲಾಬ್ಯುಲಿನ್ G HRP (SC-2004), ಅಲೋಫಿಕೊಸೈನಿನ್ (APC) ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್/ಹ್ಯೂಮನ್ CD11b, ಕ್ಲೋನ್ M1/70 (ಬಯೋಲೆಜೆಂಡ್, 101212); APC ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ F4/80, ಕ್ಲೋನ್ BM8 (ಬಯೋಲೆಜೆಂಡ್, 123115); APC-Cy7 ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ IA/IE, ಕ್ಲೋನ್ M5/114.15.2 (ಬಯೋಲೆಜೆಂಡ್, 107627); ಫೈಕೋರಿಥ್ರಿನ್ (PE)-Cy7 ಆಂಟಿ ಮೌಸ್/ಹ್ಯೂಮನ್ CD11b, ಕ್ಲೋನ್ M1/70 (ಬಯೋಲೆಜೆಂಡ್, 101215); ಫ್ಲೋರೆಸಿನ್ ಐಸೊಥಿಯೋಸೈನೇಟ್ (FITC) ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ Ly6G, ಕ್ಲೋನ್ 1A8 (BD ಬಯೋಸೈನ್ಸ್, 551460); APC ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ F4/80, ಕ್ಲೋನ್ BM8 (ಬಯೋಲೆಜೆಂಡ್, 123116); ಮೊಮೊರ್ಡಿಕಾ ಚರಂಟಿನ್ ಕ್ಲೋರೊಫಿಲ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ (PerCP) Cy5.5 ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ Ly6C, HK1.4 (ಬಯೋಲೆಜೆಂಡ್, 128011); BV421 ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ CD11c (ಬಯೋಲೆಜೆಂಡ್, 117329); V500 ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್/ಹ್ಯೂಮನ್ CD11b, ಕ್ಲೋನ್ M1 / ​​70 (BD, 562128); PE-Cy7 ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ CD45, ಕ್ಲೋನ್ I3/2.3 (ಬಯೋಲೆಜೆಂಡ್, 147704); PE ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ Ly6G, ಕ್ಲೋನ್ 1A8 (BD, 551461); ಆಂಟಿ-ಲುಕಾ ಮೊಲ ಪಾಲಿಕ್ಲೋನಲ್ ಸೀರಮ್ (35); ಮತ್ತು ಆಂಟಿ-ಲುಕಾಬಿ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯ.
ಮೌಸ್ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಹೈಬ್ರಿಡೋಮಾ ಕೋಶಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಅದರ ಅನುಮೋದಿತ ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕಾರ್ಯಾಚರಣಾ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಆಂಟಿ-ಲುಕಾಬಿ ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಎನ್ವಿಗೊ ಇಂಕ್ ಕಸ್ಟಮೈಸ್ ಮಾಡಿದೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಮರುಸಂಯೋಜಕ LukAB (rLukAB) ಅನ್ನು ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಪ್ರತಿರಕ್ಷಣೆಗಾಗಿ ಫ್ರಾಯ್ಡ್‌ನ ಸಂಪೂರ್ಣ ಸಹಾಯಕದೊಂದಿಗೆ ಎಮಲ್ಸಿಫೈಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ನಂತರ ಫ್ರಾಯ್ಡ್‌ನ ಅಪೂರ್ಣ ಸಹಾಯಕ ಎಮಲ್ಸಿಫೈಡ್ rLukAB ಯೊಂದಿಗೆ ಬೂಸ್ಟರ್ ಇಮ್ಯುನೈಸೇಶನ್‌ಗಾಗಿ, ಮತ್ತು ನಂತರ TiterMax ಸಹಾಯಕದೊಂದಿಗೆ ಎಮಲ್ಸಿಫೈಡ್ rLukAB ಅಥವಾ ಎರಡಕ್ಕೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತದೆ. ರೋಗನಿರೋಧಕ ಇಲಿಗಳನ್ನು ಬಲಿ ನೀಡಲಾಯಿತು, ಗುಲ್ಮದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಹೈಬ್ರಿಡೋಮಾಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು NS01 ಮೈಲೋಮಾ ಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಬೆಸೆಯಲಾಯಿತು. ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಹೈಬ್ರಿಡೋಮಾ ಸೆಲ್ ಲೈನ್‌ಗಳನ್ನು ELISA ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಿದೆ.
ಮೊದಲೇ ಹೇಳಿದಂತೆ, ಕೆಳಗಿನ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ SPR ಅನ್ನು ಚಲಾಯಿಸಲು Biacore T200 ಸಿಸ್ಟಮ್ (GE) ಅನ್ನು ಬಳಸಿ (12). ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, S ಸೆನ್ಸರ್ ಚಿಪ್ CM5 (GE) ಸರಣಿಯ 2 ರಿಂದ 4 ರವರೆಗಿನ ಹರಿವಿನ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಮರುಸಂಯೋಜಕ I ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು (ಮೌಸ್, ಮಾನವ ಮತ್ತು ರೂಪಾಂತರಿತ) ಸರಿಪಡಿಸಲು NHS ಕ್ಯಾಪ್ಚರ್ ಕಿಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿ ಮತ್ತು ಫ್ಲೋ ಸೆಲ್ 1 ಅನ್ನು ಖಾಲಿಯಾಗಿ ಸರಿಪಡಿಸಿ . ಏಕ-ಚಕ್ರದ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, LukAB ಅನ್ನು 0.008 ರಿಂದ 5 μg/ml ಮತ್ತು 0.16 ರಿಂದ 100 μg/ml ವರೆಗಿನ ಐದು ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಶ್ರೇಣಿಗಳಲ್ಲಿ ಎರಡು ಬ್ಯಾಚ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಯಿತು. ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಶ್ರೇಣಿಯನ್ನು ಮೂರು ಬಾರಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಎಲ್ಲಾ SPR ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಚಾಲನೆಯಲ್ಲಿರುವ ಬಫರ್ 6.8 pH ನೊಂದಿಗೆ 1×PBS ಆಗಿತ್ತು, ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಡೇಟಾವನ್ನು ಡಬಲ್ ಉಲ್ಲೇಖದಿಂದ ಕಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಹನ್ನೆರಡು ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ ಇಲಿಗಳನ್ನು CO2 ನೊಂದಿಗೆ ದಯಾಮರಣಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, 70% ಎಥೆನಾಲ್ನೊಂದಿಗೆ ಸಿಂಪಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಪಾಲಿಸ್ಟೈರೀನ್ ಫೋಮ್ ಬ್ಲಾಕ್ನಲ್ಲಿ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಯಿತು. ಮೌಸ್ ಮೂಳೆ ಮಜ್ಜೆಯ ಕೋಶಗಳ ಸಂಗ್ರಹವು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತಿರುತ್ತದೆ. ಹಿಂಗಾಲುಗಳ ಚರ್ಮ ಮತ್ತು ಸ್ನಾಯುಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ಪೃಷ್ಠದ ಮೇಲಿರುವ ಎಲುಬುಗಳನ್ನು ಛೇದಿಸಲು ತೀಕ್ಷ್ಣವಾದ ಬರಡಾದ ಕತ್ತರಿಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ. ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಸ್ನಾಯುವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ, ಎಲುಬು ಮತ್ತು ಮೊಳಕಾಲುಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಿ, ಮತ್ತು ತಣ್ಣನೆಯ RPMI/10% ಭ್ರೂಣದ ಗೋವಿನ ಸೀರಮ್ (FBS) ನಲ್ಲಿ ಆರು ಬಾವಿಗಳ ತಟ್ಟೆಯಲ್ಲಿ ಐಸ್ ಮೇಲೆ ಇರಿಸಿ. ಮೂಳೆಯಿಂದ ಆಸ್ಟಿಯೋಫೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ಮೂಳೆ ಮಜ್ಜೆಯನ್ನು 10 ಮಿಲಿ ಆರ್‌ಪಿಎಂಐ/10% ಎಫ್‌ಬಿಎಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಫ್ಲಶ್ ಮಾಡಿ. ಮೂಳೆ ಮಜ್ಜೆಯನ್ನು ನಂತರ ಸೆಲ್ ಸ್ಟ್ರೈನರ್ ಮೂಲಕ ರವಾನಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಉಳಿದ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 1500 ಆರ್‌ಪಿಎಂನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕೆಂಪು ರಕ್ತ ಕಣಗಳನ್ನು (RBC) ತೆಗೆದುಹಾಕಲು, ಹೊಸದಾಗಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾದ ಮೂಳೆ ಮಜ್ಜೆಯ ಕೋಶಗಳಿಗೆ 2 ಮಿಲಿ ಎಸಿಕೆ (ಅಮೋನಿಯಂ-ಕ್ಲೋರಿನ್-ಪೊಟ್ಯಾಸಿಯಮ್) ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 2 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಿ. ನಂತರ 10 ಮಿಲಿ RPMI ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್ ಅನ್ನು ತಟಸ್ಥಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೋಶಗಳನ್ನು 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 1500 rpm ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲಾಯಿತು. ಕೋಶಗಳನ್ನು ನಂತರ 10ml RPMI/10% FBS ನಲ್ಲಿ ಮರುಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಎಣಿಕೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು.
ಮೂಳೆ ಮಜ್ಜೆಯ ಕೋಶಗಳನ್ನು (1×106) ಸಂಸ್ಕರಿಸದ 10 ಸೆಂ.ಮೀ ಪೆಟ್ರಿ ಭಕ್ಷ್ಯದಲ್ಲಿ ಲೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಡುಲ್ಬೆಕೊದ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ ಈಗಲ್ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ (DMEM) 30% L-929 ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ (ATCC CCL-1) ಅನ್ನು ಪೆಟ್ರಿ ಭಕ್ಷ್ಯದಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು. ವ್ಯತ್ಯಾಸದ 3 ನೇ ದಿನದಂದು 5 ಮಿಲಿ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ. ಮ್ಯಾಕ್ರೋಫೇಜ್ ಡಿಫರೆನ್ಸಿಯೇಶನ್‌ನ 7 ನೇ ದಿನದಂದು, J2 ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್‌ಗಳ (ಕಗನ್ ಲ್ಯಾಬೊರೇಟರೀಸ್) (29) ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು 0.45-μm ಫಿಲ್ಟರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. BMDM ಅನ್ನು 50% J2 ಸ್ಥಿತಿಯ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್ ಮತ್ತು 50% L-929 ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್‌ನಲ್ಲಿ 7 ದಿನಗಳವರೆಗೆ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು J2 ಮತ್ತು L-929 ಮಿಶ್ರ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್‌ನ ಹೊಸ ಬ್ಯಾಚ್ ಅನ್ನು ಮೂರನೇ ದಿನದಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ನಂತರ 90% ಸಂಗಮವಾಗುವವರೆಗೆ DMEM ಅನ್ನು ಪೂರ್ಣಗೊಳಿಸಲು 30% L-929 ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿ. ನಂತರ 20% ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು 25% L-929 ಸೂಪರ್ನಾಟಂಟ್ ಹೊಂದಿರುವ ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ಈ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ, ಪ್ರತಿ ಅಂಗೀಕಾರದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಅಖಂಡ DMEM ನಲ್ಲಿ L-929 ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್‌ನ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 5% ರಷ್ಟು ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ, ಅದು L-929 ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್ ಇಲ್ಲದೆ DMEM ನಲ್ಲಿ BMDM ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬೆಳೆಯುತ್ತದೆ.
HEK293T ಜೀವಕೋಶಗಳು ಮತ್ತು iBMDM ಗಳನ್ನು DMEM ನಲ್ಲಿ 5% (v/v) CO2 ನೊಂದಿಗೆ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 10% (v/v) FBS ಮತ್ತು ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್ (100 U ml-1) ಮತ್ತು ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (0.1 mg ml-1) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ. ಬೇರೆ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಹೇಳದ ಹೊರತು.
iBMDM ಗಳನ್ನು DMEM + 10% FBS + 1x ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್/ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್‌ನಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ. V-ಬಾಟಮ್ 96-ವೆಲ್ ಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು (2×105) ಹರಡಿ, PBS ನೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಿರಿ ಮತ್ತು PBS ನಲ್ಲಿ 25μl APC ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್/ಹ್ಯೂಮನ್ CD11b, APC ಆಂಟಿ-ಮೌಸ್ F4/80 ಅಥವಾ APC-Cy7 ಆಂಟಿ ಬಳಸಿ 1: 300 IA/IE ಮತ್ತು Fc ಬ್ಲಾಕರ್ (ಬಯೋಲೆಜೆಂಡ್, 101320) 1:300 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ. ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಲೆ ಹಾಕಲಾಯಿತು, PBS ನೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು PBS ನಲ್ಲಿ 2% ಪ್ಯಾರಾಫಾರ್ಮಾಲ್ಡಿಹೈಡ್ (PFA), 2% ಶಾಖ-ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ FBS, ಮತ್ತು 0.5% ಸೋಡಿಯಂ ಅಜೈಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಸೈಟೊಫ್ಲೆಕ್ಸ್ ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೀಟರ್ (ಬೆಕ್‌ಮನ್ ಕೌಲ್ಟರ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಫ್ಲೋಜೋ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಟ್ರೀಸ್ಟಾರ್ ಇಂಕ್.) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.
ರಾತ್ರಿಯ ಸಂಸ್ಕೃತಿ AH-LACUSA300-ΔlukABhlg::tet lukED::kan lukSF::spec-pOS1sGFP ಅನ್ನು 1:100 ರಲ್ಲಿ TSB + ಕ್ಲೋರಂಫೆನಿಕೋಲ್ (10 μg/ml) ನಲ್ಲಿ ಉಪಸಂಸ್ಕೃತಿಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮಧ್ಯ-ಲಾಗ್ ಹಂತಕ್ಕೆ ಬೆಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ ಮತ್ತು ಅವುಗಳನ್ನು ಸಂಸ್ಕೃತಿಯ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಪುನಃ ಜೋಡಿಸಿ ಮತ್ತು 5×107 CFU/ml ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ. ಸಮ್ಮಿಳನಗೊಂಡ iBMDM ಅನ್ನು 5×105 ಜೀವಕೋಶಗಳು/ಮಿಲಿ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಕಲ್ಚರ್ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ತೊಳೆದು ಪುನಃ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. 25 μl 5×107 CFU/ml ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾ ಮತ್ತು 50 μl ಮಧ್ಯಮ ಅಥವಾ 2% ಮೌಸ್ ಸೀರಮ್ ಅನ್ನು 96-ಬಾವಿ U- ಆಕಾರದ ಕೆಳಭಾಗದ ಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಬಾವಿಗಳಿಗೆ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಅಲುಗಾಡುವ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ 1 ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಮೊದಲೇ ಕಾವುಕೊಡಿ. ಪ್ರತಿ ಮಿಲಿಲೀಟರ್‌ಗೆ 5×105 iBMDM ನ 25 ಮೈಕ್ರೋಲೀಟರ್‌ಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು ಅಲುಗಾಡುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಿ. ಮಾದರಿಯನ್ನು ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು 100μl ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಕ್ರಿಯ ಕೋಶ ವಿಂಗಡಣೆ (FACS) ಸ್ಥಿರೀಕರಣ ಬಫರ್ [PBS + 2% FBS + 2% PFA + 0.05% (w/v) ಸೋಡಿಯಂ ಅಜೈಡ್] ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ನಿಲ್ಲಿಸಿ. . ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಸೈಟೊಫ್ಲೆಕ್ಸ್ ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೀಟರ್ (ಬೆಕ್‌ಮನ್ ಕೌಲ್ಟರ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಫ್ಲೋಜೋ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಟ್ರೀಸ್ಟಾರ್ ಇಂಕ್.) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು. ಫಾಗೊಸೈಟೋಸಿಸ್ % GFP ಧನಾತ್ಮಕ ಜೀವಕೋಶಗಳೆಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗಳನ್ನು ಟೇಬಲ್ S5 ರಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಟೇಬಲ್ S6 ನಲ್ಲಿನ ಆಲಿಗೋನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೋಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, pCMV6-ಎಂಟ್ರಿ ಮೌಸ್ CD11b HI-ಡೊಮೈನ್ ಮತ್ತು pCMV6-ಎಂಟ್ರಿ ಮೌಸ್ CD11b HMH 7-ಡೊಮೇನ್ ಅನ್ನು ಫಾಸ್ಟ್‌ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ (36) ಮೂಲಕ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅನುಕ್ರಮದಿಂದ ದೃಢೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.
HEK293T ಕೋಶಗಳನ್ನು ಟೇಬಲ್ S6 ನಲ್ಲಿ ಪಟ್ಟಿ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಫಾಸ್ಫೇಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಪ್ರತಿ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ನ 10 μg/ml ಮತ್ತು 75 μl 2.5M CaCl 2 ಅನ್ನು 750 μl ನ ಅಂತಿಮ ಪರಿಮಾಣಕ್ಕೆ ಡಿಯೋನೈಸ್ಡ್ ನೀರಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಗಾಳಿಯಾಡಿಸುವಾಗ, 750 ಮೈಕ್ರೋಲೀಟರ್‌ಗಳ 2x HEPES ಬಫರ್ಡ್ ಸಲೈನ್ (HBS) [50 mM HEPES (pH 7.05), 280 mM NaCl ಮತ್ತು 1.5 mM Na2PO4] ಡ್ರಾಪ್‌ವೈಸ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿ. ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ 30 ರಿಂದ 40% ರಷ್ಟು ಸಂಗಮಿಸುವ HEK293T ಕೋಶಗಳೊಂದಿಗೆ 10 cm ಪ್ಲೇಟ್‌ಗೆ ಡ್ರಾಪ್‌ವೈಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ವರ್ಗಾವಣೆಯಾದ ಆರು ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಪೂರ್ವ-ಬೆಚ್ಚಗಿನ DMEM + 10% FBS ಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ವರ್ಗಾವಣೆಯಾದ 14 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ EZ-ಲಿಂಕ್ NHS-PEG4-ಬಯೋಟಿನ್ ತೂಕವಿಲ್ಲದ ಸ್ವರೂಪವನ್ನು (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಬಯೋಟೈನೈಲೇಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 1x PBS ನಲ್ಲಿ ಡಯಾಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. EZ-Link NHS-PEG4-ಬಯೋಟಿನ್ ಕಾರಕವನ್ನು 1:20 ರ ಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 1x PBS ನಲ್ಲಿ ಡಯಾಲಿಸಿಸ್ ಮೂಲಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸದ ಬಯೋಟಿನ್ ಕಾರಕವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ. ನಂತರ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್-ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ, ಅಲಿಕೋಟ್ ಮತ್ತು -80 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ವರ್ಗಾವಣೆಗೊಂಡ HEK293T ಕೋಶಗಳನ್ನು (1×105), iBMDM ಅಥವಾ ಪೆರಿಟೋನಿಯಲ್ ಎಕ್ಸೂಡೇಟಿವ್ ಕೋಶಗಳನ್ನು V-ಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಪ್ರತಿ ಬಾವಿಗೆ ಸೇರಿಸಿ, PBS ನೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆಯಿರಿ ಮತ್ತು ನಂತರ 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಸೂಚಿಸಲಾದ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ PBS ನಲ್ಲಿ 50μl ಬಯೋಟಿನೈಲೇಟೆಡ್ LukAB ನೊಂದಿಗೆ ಕಾವುಕೊಡಿ. . LukAB ಚಿಕಿತ್ಸೆಯ ಮೊದಲು, iBMDM ಮತ್ತು Fc ಬ್ಲಾಕರ್ (1:100) ಅನ್ನು 37 ° C ನಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆ ಕಾಲ ಪೂರ್ವ-ಕಾವು ಮಾಡಲಾಗಿತ್ತು. PBS ನೊಂದಿಗೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಿರಿ ಮತ್ತು PerCP Cy5.5 streptavidin (1:300) (BioLegend, 405214), APC CD11b (1:300) (BioLegend, 101212) ಮತ್ತು Fixable Viability Dye eFluor Staining) 1:150 ಅನ್ನು ಬಳಸಿ (eBioscience, 65-0863-18) 40 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ PBS ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು. PBS ನೊಂದಿಗೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಿರಿ ಮತ್ತು FACS ಸ್ಥಿರೀಕರಣ ಬಫರ್ [PBS + 2% FBS + 2% PFA + 0.05% (w/v) ಸೋಡಿಯಂ ಅಜೈಡ್] ನಲ್ಲಿ ಮರುಜೋಡಿಸಿ. ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಸೈಟೊಫ್ಲೆಕ್ಸ್ ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೀಟರ್ (ಬೆಕ್‌ಮನ್ ಕೌಲ್ಟರ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಫ್ಲೋಜೋ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಟ್ರೀಸ್ಟಾರ್ ಇಂಕ್.) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.
WT ಅಥವಾ hCD11b ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಸಂಪೂರ್ಣ ಮೌಸ್ iBMDM ಅನ್ನು 4% ಫಾರ್ಮಾಲ್ಡಿಹೈಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ, PBS ನೊಂದಿಗೆ 3 ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 106 ಜೀವಕೋಶಗಳು/ml ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಮರುಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮುಬೈವಾ ಮತ್ತು ಇತರರು ವಿವರಿಸಿದ ರೀತಿಯಲ್ಲಿಯೇ ಒಂದು ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿ, ಬಯಾಕೋರ್ T200 ನಿಯಂತ್ರಣ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ C1 ಮಾಂತ್ರಿಕ ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿ, ಸರಣಿ C1 C1 ಸಂವೇದಕ ಚಿಪ್‌ನಲ್ಲಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಿ. (37) ಚಿಪ್ ಅನ್ನು ಸ್ಯಾಚುರೇಟೆಡ್ ಸ್ಥಿತಿಗೆ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲು ಜೀವಕೋಶಗಳು 5μl/min ವೇಗದಲ್ಲಿ 900 ಸೆ. ಎರಡು ಉಲ್ಲೇಖ ಕಡಿತಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಫ್ಲೋ ಸೆಲ್ 1 ಅನ್ನು ಖಾಲಿ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಸರಿಪಡಿಸಿ. LukAB 8 nM ನಿಂದ 5 μM ವರೆಗಿನ ಹರಿವಿನ ದರದಲ್ಲಿ ನಿಶ್ಚಲ ಕೋಶಗಳ ಮೂಲಕ ಹರಿಯುತ್ತದೆ.
ಕೊಯ್ಲಿಗೆ 24 ಗಂಟೆಗಳು ಮತ್ತು 48 ಗಂಟೆಗಳ ಮೊದಲು, 8 ರಿಂದ 9 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ WT ಅಥವಾ hCD11b C57BL/6 ಇಲಿಗಳನ್ನು 1×108 CFU ಶಾಖ-ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ನ್ಯೂಮನ್ ಸ್ಟ್ರೈನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಇಂಟ್ರಾಪೆರಿಟೋನಿಯಲ್ ಆಗಿ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. ಇಲಿಗಳನ್ನು CO2 ನೊಂದಿಗೆ ದಯಾಮರಣಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು RPMI + 0.1% ಮಾನವ ಸೀರಮ್ ಅಲ್ಬುಮಿನ್ (HSA) + 10 mM HEPES ಅನ್ನು ಪೆರಿಟೋನಿಯಲ್ ಕುಹರದೊಳಗೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮಸಾಜ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ಮತ್ತು ತೊಳೆಯಿರಿ. 3 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 37 ° C ನಲ್ಲಿ 5% (v/v) CO2 ನಲ್ಲಿ LukAB ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು (150,000) ಕಾವುಕೊಡಿ. ಕೋಶಗಳನ್ನು PBS ನೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು PE-Cy7 CD11b (ಬಯೋ ಲೆಜೆಂಡ್, 101215), FITC Ly6G (BD, 557396), APC F4/80 (BioLegend, 123116), PerCP Cy5.5 Ly46C (BioLegend, 128V401), CD11c (BioLegend) , 117329) ಮತ್ತು Fc ನೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ PBS ನಲ್ಲಿ 1:200 ಅನ್ನು ಐಸ್‌ನಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ. ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆದು PBS + 5% FBS + ಪ್ರೊಪಿಡಿಯಮ್ ಅಯೋಡೈಡ್ (PI) (2 μg/ml) (G-Biosciences) ನಲ್ಲಿ ಪುನಃ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ತಕ್ಷಣವೇ CytoFLEX ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೀಟರ್ (ಬೆಕ್‌ಮನ್ ಕೌಲ್ಟರ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಿ ಮತ್ತು ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು FlowJo ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಟ್ರೀಸ್ಟಾರ್ ಇಂಕ್.) ಬಳಸಿ.
C57BL/6J ಫಲವತ್ತಾದ ಮೊಟ್ಟೆಗಳನ್ನು ಸೂಪರ್‌ವೋಲೇಟೆಡ್ C57BL/6J ಇಲಿಗಳಿಂದ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಮಾರ್ಗದರ್ಶಿ RNA (50 ng/μl) ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ 45μl ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾದ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಮಿಶ್ರಣದೊಂದಿಗೆ ಮೈಕ್ರೊಇನ್ಜೆಕ್ಷನ್ [Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (IDT, ಮಾರ್ಗದರ್ಶಿ ಅನುಕ್ರಮ: CATGGGGCTGCTACACATCAG)] + Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA (IDT, 2RT5307), ಟ್ರಿಸ್-ಇಡಿಟಿಎ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಕ್ಯಾಸ್9 ನ್ಯೂಕ್ಲೀಸ್ (80 ng/μl; ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜನ್) ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ DNA (10 ng/ml) (ಟೇಬಲ್ S6). ಮಾರ್ಗದರ್ಶಿ RNA ಮತ್ತು DNA ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು Benchling.com ನಲ್ಲಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ. ಜೀನೋಟೈಪಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಸುಲಭಗೊಳಿಸಲು Xho I ನಿರ್ಬಂಧದ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು DNA ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗೆ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಚುಚ್ಚುಮದ್ದಿನ ಫಲವತ್ತಾದ ಮೊಟ್ಟೆಗಳನ್ನು ಸೂಡೊಪ್ರೆಗ್ನೆಂಟ್ CD-1 (ಚಾರ್ಲ್ಸ್ ರಿವರ್ ಲ್ಯಾಬೊರೇಟರಿ) ಹೆಣ್ಣು ಪ್ರಾಣಿಗಳಿಗೆ ಅಳವಡಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ 15 ನಾಯಿಮರಿಗಳನ್ನು ಇಟ್ಗಾಮ್ ಎಕ್ಸಾನ್ 9 ರಲ್ಲಿ ನಿರೀಕ್ಷಿತ ಮಾರ್ಪಾಡು ಎನ್ಕೋಡಿಂಗ್ ಆಲೀಲ್ ಅನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು. ಜೀನೋಮಿಕ್ DNA ಮಾದರಿಯನ್ನು ವರ್ಧಿಸಿ (ಟೇಬಲ್ S6), 379 ಬೇಸ್ ಜೋಡಿಗಳ (bp) ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಚೈನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್ (PCR) ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಿ, ಮತ್ತು Xho I. XhoI ನೊಂದಿಗೆ ಕತ್ತರಿಸಿ 15 ಪ್ರಾಣಿಗಳಲ್ಲಿ 7 ರಿಂದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕತ್ತರಿಸಿ, ಮತ್ತು Xho I ಕತ್ತರಿಸಿದ PCR ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು. ಈ ಪ್ರಾಣಿಗಳನ್ನು ಅನುಕ್ರಮಗೊಳಿಸಿ. ನಿರೀಕ್ಷಿತ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ ಇಬ್ಬರು ರಚನೆಕಾರರನ್ನು ನಾಲ್ಕು ತಲೆಮಾರುಗಳಿಗೆ C57BL/6J ಇಲಿಗಳಿಗೆ ಬ್ಯಾಕ್‌ಕ್ರಾಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ನಂತರ ನಿರೀಕ್ಷಿತ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳೊಂದಿಗೆ G4 ಪ್ರಾಣಿಗಳು ವಸಾಹತು ಪುಷ್ಟೀಕರಣ ಮತ್ತು ಡೌನ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಸಂಶೋಧನೆಗಾಗಿ ಎರಡು ಸ್ವತಂತ್ರ ತಳಿಗಳಿಂದ ಹೋಮೋಜೈಗಸ್ ತಳಿ ಜೋಡಿಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ದಾಟುತ್ತವೆ.
ಇಲಿಗಳನ್ನು ಆಂತರಿಕವಾಗಿ ಬೆಳೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ರೋಗಕಾರಕ-ಮುಕ್ತ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 8 ರಿಂದ 9 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನಲ್ಲಿ ವಯಸ್ಸಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಲಿಂಗಕ್ಕೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ hCD11b ಮತ್ತು WT C57BL/6J ಇಲಿಗಳನ್ನು ಬಳಸುವುದು hCD11b het×het ಕ್ರಾಸ್‌ಗಳಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಒಡಹುಟ್ಟಿದವರು. ಇಲಿಗಳನ್ನು ಅವುಗಳ ಜೀನೋಟೈಪ್ ಮತ್ತು ಲಿಂಗದಲ್ಲಿ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿ ಬೆರೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಗುಂಪುಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಎಂಟರಿಂದ ಒಂಬತ್ತು ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ WT ಅಥವಾ hCD11b ಹೋಮೋಜೈಗಸ್ C57BL/6 ಇಲಿಗಳು ಕಕ್ಷೆಯ ಮೂಲಕ ಸುಮಾರು 3×106, 1×107 ಅಥವಾ 1×108 CFU ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್‌ನಿಂದ ಸೋಂಕಿಗೆ ಒಳಗಾಗಿದ್ದವು. G4 het×het ಕ್ರಾಸ್‌ನಿಂದ ಪಡೆದ hCD11b ಹೋಮೋಜೈಗಸ್ ಇಲಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಆರಂಭಿಕ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. WT ಕಸವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತಿತ್ತು. G4 ಹೋಮೋ×ಹೋಮೋ ಕ್ರಾಸ್‌ನಿಂದ ಪಡೆದ hCD11b ಹೋಮೋಜೈಗಸ್ ಇಲಿಗಳೊಂದಿಗೆ ನಂತರದ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು. ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್ ಸ್ಟ್ರೈನ್ USA300 ಸ್ಟ್ರೈನ್ LAC ನಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಇದನ್ನು ಟೇಬಲ್ S4 ನಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸೋಂಕಿನ ಒಂದು ಅಥವಾ ಮೂರು ದಿನಗಳ ನಂತರ, ಇಲಿಗಳನ್ನು CO2 ನೊಂದಿಗೆ ದಯಾಮರಣಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಯಕೃತ್ತು ಮತ್ತು ಮೂತ್ರಪಿಂಡವನ್ನು ಹೊರತೆಗೆಯಲಾಯಿತು, ಬರಡಾದ PBS ನಲ್ಲಿ ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ಸರಣಿಯಾಗಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ CFU ಎಣಿಕೆಗಾಗಿ TSA ಮೇಲೆ ಲೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರತಿ ತಳಿಗೆ ಎರಡರಿಂದ ಮೂರು ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಮೌಸ್ ಆಂಟಿ-ಲುಕಾ (2μg/ml) ಮೊನೊಕ್ಲೋನಲ್ ಪ್ರತಿಕಾಯವನ್ನು ಇಮ್ಮುಲೋನ್ 2HB 96-ವೆಲ್ ಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಬಾವಿಗಳಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಬೊನೇಟ್-ಬೈಕಾರ್ಬನೇಟ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಲೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ. ಬಾವಿಗಳನ್ನು ಬ್ಲಾಟಿಂಗ್ ಬಫರ್ (2% ನಾನ್-ಫ್ಯಾಟ್ ಡ್ರೈ ಹಾಲು, 0.9% NaCl, 0.05% ಟ್ವೀನ್ 20, PBS) ನೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ, 1x ರೇಡಿಯೊಇಮ್ಯುನೊಪ್ರೆಸಿಪಿಟೇಶನ್ ಅಸ್ಸೇ ಬಫರ್ (Abcam) + 1x ಹಾಲ್ಟ್ ಪ್ರೋಟೀಸ್ ಇನ್ಹಿಬಿಟರ್‌ನಲ್ಲಿ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯಿಂದ ಸೋಂಕು ತಗುಲಿತು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಕಾಕ್ಟೈಲ್ (ಥರ್ಮೋ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಜೊತೆಗೆ 1 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಅಲುಗಾಡುವ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ. ಬಾವಿಗಳನ್ನು ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆಂಟಿ-ಲುಕಾ ಮೊಲದ ಸೀರಮ್ (35) ನೊಂದಿಗೆ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಗೆ 1:500 ರಷ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮುಂದೆ, ಕೊಠಡಿ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ 1 ಗಂಟೆಗೆ 1: 2500 ರಷ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಬಾವಿಗಳನ್ನು ಮೊಲ-ವಿರೋಧಿ HRP ಯೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆದು ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಬಾವಿಗಳನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ ಮತ್ತು 100 μl TMB ತಲಾಧಾರದೊಂದಿಗೆ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಿ. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು 100 μl ಸಲ್ಫ್ಯೂರಿಕ್ ಆಮ್ಲದೊಂದಿಗೆ ಕೊನೆಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 450 nm ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. LukAB (ಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳು/ಆರ್ಗನ್) ಅನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಯೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು LukAB ಅನ್ನು ತಿಳಿದಿರುವ ಪ್ರಮಾಣದ ಅಂಗಗಳಲ್ಲಿ LukAB ಅನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
8 ರಿಂದ 9 ವಾರಗಳ ವಯಸ್ಸಿನ C57BL/6 ಇಲಿಗಳನ್ನು PBS ಅಥವಾ ಸ್ಟ್ಯಾಫಿಲೋಕೊಕಸ್ ಔರೆಸ್‌ನ ಸುಮಾರು 1×107 CFU ನೊಂದಿಗೆ ರೆಟ್ರೊ-ಕಕ್ಷೀಯವಾಗಿ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು. ಸೋಂಕಿನ ಒಂದು ದಿನದ ನಂತರ, ಇಲಿಗಳನ್ನು ದಯಾಮರಣಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. ಯಕೃತ್ತು ಮತ್ತು ಮೂತ್ರಪಿಂಡವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು, RPMI ನಲ್ಲಿ ಏಕರೂಪಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ 200 U ವಿಧದ VIII ಕಾಲಜಿನೇಸ್ (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, C2139) ಮತ್ತು 0.2 mg DNase I (ಸಿಗ್ಮಾ-ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, DN25) ನಲ್ಲಿ ಜೀರ್ಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಹೋಮೋಜೆನೇಟ್ ಅನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ, ತೊಳೆದು 40/80% ಪರ್ಕಾಲ್ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್‌ಗೆ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಬಿಳಿ ರಕ್ತ ಕಣ ಪದರವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಅನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡಿ. RBC ಯನ್ನು 1×BD ಫಾರ್ಮ್ ಲೈಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. V500 CD11b (BD, 562128), PE-Cy7 CD45 (BioLegend, 147704), PE Ly6G (BD, 551461), APC F4/80 (BioLegend, 123116) ಮತ್ತು Fc ಅನ್ನು PBS 1:20 ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಡಿಲುಷನ್ 1:20 ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಐಸ್ ಮೇಲೆ ಸ್ಟೇನ್ ಇರಿಸಿ, ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಿರಿ ಮತ್ತು FACS ಸ್ಥಿರೀಕರಣ ಬಫರ್ [PBS + 2% FBS + 2% PFA + 0.05% (w/v) ಸೋಡಿಯಂ ಅಜೈಡ್] ನಲ್ಲಿ ಮರುಹೊಂದಿಸಿ. ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೆಟ್ರಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಸೈಟೊಫ್ಲೆಕ್ಸ್ ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೀಟರ್ (ಬೆಕ್‌ಮನ್ ಕೌಲ್ಟರ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಫ್ಲೋಜೋ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (ಟ್ರೀಸ್ಟಾರ್ ಇಂಕ್.) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.
ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ವಿವರಗಳು ("n" ಸಂಖ್ಯೆಗಳು, ಬಳಸಿದ ಪರೀಕ್ಷೆ ಮತ್ತು ದೋಷ ಪಟ್ಟಿಗಳ ವ್ಯಾಖ್ಯಾನ) ದಂತಕಥೆಯಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಫ್ಲೋ ಸೈಟೋಮೀಟರ್ ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು FlowJo ಬಳಸಿ. ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು Prism 7.0 b, ಟ್ಯೂಕಿಯ ಪೋಸ್ಟ್ ಹಾಕ್ ಪರೀಕ್ಷೆ, ಚಿ-ಸ್ಕ್ವೇರ್ ಪರೀಕ್ಷೆ ಅಥವಾ ಜೋಡಿಯಾಗದ ಒಂದು-ಬಾಲದ ಅಥವಾ ಎರಡು-ಬಾಲದ ವಿದ್ಯಾರ್ಥಿ t ಪರೀಕ್ಷೆ (ತೋರಿಸಿರುವಂತೆ) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಬಹು ಹೋಲಿಕೆಗಳೊಂದಿಗೆ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ದ್ವಿಮುಖ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ANOVA) ಬಳಸಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಈ ಲೇಖನಕ್ಕೆ ಪೂರಕ ಸಾಮಗ್ರಿಗಳಿಗಾಗಿ, ದಯವಿಟ್ಟು https://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/11/eaax7515/DC1 ಅನ್ನು ನೋಡಿ
ಇದು ಕ್ರಿಯೇಟಿವ್ ಕಾಮನ್ಸ್ ಅಟ್ರಿಬ್ಯೂಷನ್-ವಾಣಿಜ್ಯೇತರ ಪರವಾನಗಿಯ ನಿಯಮಗಳ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ವಿತರಿಸಲಾದ ಮುಕ್ತ ಪ್ರವೇಶ ಲೇಖನವಾಗಿದೆ, ಇದು ಯಾವುದೇ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಬಳಕೆ, ವಿತರಣೆ ಮತ್ತು ಪುನರುತ್ಪಾದನೆಯನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ, ಅಂತಿಮ ಬಳಕೆಯು ವಾಣಿಜ್ಯ ಲಾಭಕ್ಕಾಗಿ ಅಲ್ಲ ಮತ್ತು ಪ್ರಮೇಯವು ಮೂಲ ಕೃತಿ ಸರಿಯಾಗಿದೆ. ಉಲ್ಲೇಖ.
ಗಮನಿಸಿ: ಇಮೇಲ್ ವಿಳಾಸವನ್ನು ಒದಗಿಸಲು ಮಾತ್ರ ನಾವು ನಿಮ್ಮನ್ನು ಕೇಳುತ್ತೇವೆ ಇದರಿಂದ ನೀವು ಪುಟಕ್ಕೆ ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುವ ವ್ಯಕ್ತಿಗೆ ನೀವು ಇಮೇಲ್ ಅನ್ನು ನೋಡಲು ಬಯಸುತ್ತೀರಿ ಮತ್ತು ಇಮೇಲ್ ಸ್ಪ್ಯಾಮ್ ಅಲ್ಲ ಎಂದು ತಿಳಿಯುತ್ತದೆ. ನಾವು ಯಾವುದೇ ಇಮೇಲ್ ವಿಳಾಸಗಳನ್ನು ಸೆರೆಹಿಡಿಯುವುದಿಲ್ಲ.
ನೀವು ಮಾನವ ಸಂದರ್ಶಕರೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಮತ್ತು ಸ್ವಯಂಚಾಲಿತ ಸ್ಪ್ಯಾಮ್ ಸಲ್ಲಿಕೆಗಳನ್ನು ತಡೆಯಲು ಈ ಪ್ರಶ್ನೆಯನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಲೇಖಕ: ಕೆಎಂ ಬೊಗುಸ್ಲಾವ್ಸ್ಕಿ, ಎಎನ್ ಮೆಕ್‌ಕೌನ್, ಸಿಜೆ ಡೇ, ಕೆಎ ಲೇಸಿ, ಕೆ.ಟಾಮ್, ಎನ್.ವೊಜಿಲ್ಲಾ, ಎಸ್‌ವೈ ಕಿಮ್, ಎಂಪಿ ಜೆನ್ನಿಂಗ್ಸ್, ಎಸ್‌ಬಿ ಕೊರಾಲೋವ್, ಎನ್‌ಸಿ ಎಲ್ಡೆ, ವಿಜೆ ಟೊರೆಸ್
MRSA ಟಾಕ್ಸಿನ್ LukAB ನ ಜಾತಿಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಜಯಿಸಲು ಹೊಸ ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಳಸುವುದರಿಂದ Vivo ನಲ್ಲಿ LukAB ಪಾತ್ರವನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಬಹುದು.
ಲೇಖಕ: ಕೆಎಂ ಬೊಗುಸ್ಲಾವ್ಸ್ಕಿ, ಎಎನ್ ಮೆಕ್‌ಕೌನ್, ಸಿಜೆ ಡೇ, ಕೆಎ ಲೇಸಿ, ಕೆ.ಟಾಮ್, ಎನ್.ವೊಜಿಲ್ಲಾ, ಎಸ್‌ವೈ ಕಿಮ್, ಎಂಪಿ ಜೆನ್ನಿಂಗ್ಸ್, ಎಸ್‌ಬಿ ಕೊರಾಲೋವ್, ಎನ್‌ಸಿ ಎಲ್ಡೆ, ವಿಜೆ ಟೊರೆಸ್
MRSA ಟಾಕ್ಸಿನ್ LukAB ನ ಜಾತಿಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಜಯಿಸಲು ಹೊಸ ಮೌಸ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಳಸುವುದರಿಂದ Vivo ನಲ್ಲಿ LukAB ಪಾತ್ರವನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಬಹುದು.
©2021 ಅಮೇರಿಕನ್ ಅಸೋಸಿಯೇಷನ್ ​​ಫಾರ್ ದಿ ಅಡ್ವಾನ್ಸ್‌ಮೆಂಟ್ ಆಫ್ ಸೈನ್ಸ್. ಎಲ್ಲ ಹಕ್ಕುಗಳನ್ನು ಕಾಯ್ದಿರಿಸಲಾಗಿದೆ. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ಮತ್ತು COUNTER ನ ಪಾಲುದಾರ. ಸೈನ್ಸ್ ಅಡ್ವಾನ್ಸ್ ISSN 2375-2548.