Бисёре аз патогенҳо бар зидди соҳибони табиии худ омилҳои вирулентиро ба вуҷуд меоранд. Аз ҷиҳати клиникӣ, изолятҳои ба метициллин тобовар Staphylococcus aureus (MRSA) ба одамон хеле мутобиқ шудаанд ва як қатор омилҳои вируленсионии хоси инсонро ба вуҷуд меоранд. Яке аз чунин омилҳо LukAB аст, як токсики ба наздикӣ кашфшуда, ки ба фагоситҳои инсон тавассути пайвастшавӣ ба ҷузъи интегрин CD11b нигаронида шудааст. LukAB ба CD11b инсон тропизми қавӣ нишон медиҳад, аммо на ба хояндаҳо. Дар ин ҷо, таҳқиқоти филогенетикӣ ва биохимиявӣ ба муайян кардани 11 доменҳои боқимонда, ки барои хосияти LukAB ба CD11b-и инсон заруранд, оварда расонид, ки барои мувофиқ кардани CD11b мурин бо пайванди токсин кофӣ аст. Барои иваз кардани ин домен таҳриркунии ген бо миёнаравии CRISPR истифода шуд, ки дар натиҷа мушҳои "инсонӣ" пайдо шуданд. Тадқиқотҳои in vivo нишон доданд, ки мушҳои инсонӣ ба сирояти гардиши хуни MRSA (фенотип бо миёнаравии LukAB) ҳассостаранд. Аз ин рӯ, ин таҳқиқот LukAB-ро ҳамчун токсинҳои муҳими бактериемияи MRSA муайян мекунанд ва модели нави мушро барои омӯзиши патобиологияи MRSA тавсиф мекунанд.
Барои одамон, якчанд микроорганизмҳои марговар ва маъмултарин ба намудҳо хосанд ва метавонанд танҳо ба одамон ё приматҳои ғайриинсонии ба наздик алоқаманд сироят кунанд (1). Дигар микроорганизмҳои патогении инсон қобилияти сироят кардани намудҳои васеътари намудҳоро доранд, аммо ин сироятҳо бемориҳои инсониро дуруст ҷамъбаст намекунанд. Тропизми мизбонро метавон тавассути омилҳои маҳдудкунандаи мизбон, ретсепторҳои номувофиқ, ки барои ҳуҷуми патоген ё пайвастшавӣ заруранд, фарқият дар ҳамкорӣ бо системаи иммунии мизбон ё фарқият дар истифодаи маводи ғизоӣ муайян кард (1). Якҷоя эволютсияи микроорганизмҳо ва мизбонҳо мутақобилаи мушаххаси мизбон ва патогенро барои зинда мондан ва такрористеҳсоли микроорганизмҳо интихоб мекунад. Ҳамзамон, омилҳои иммунии мизбон ва молекулаҳои ба патоген нигаронидашуда таҳаввул хоҳанд кард, то аз ҷониби патогенҳо эътироф нашаванд ва ҳамзамон онҳо метавонанд вазифаҳои иммуниро интихоб кунанд. Ин таъсироти мутақобила метавонад ҳамчун "мусобиқаи силоҳи молекулавӣ" ба вуҷуд ояд, ки дар он патогенҳо ва мизбонҳо бояд ҳамеша барои зинда мондан мутобиқ шаванд. Аз ин рӯ, патогенҳо метавонанд дар навъҳои нашъунамои худ ба таври баланд тахассус шаванд.
Staphylococcus aureus тақрибан 30% аҳолиро ташкил медиҳад ва дар сӯрохи бинӣ, пӯст ва рӯдаи меъдаю рӯда ҷойгир аст (2). Бо вуҷуди ин, вақте ки Staphylococcus aureus ба бофтаҳои амиқтар ворид мешавад, он метавонад сироятҳои гуногун ва ҷиддӣ, аз ҷумла сироятҳои пӯст ва бофтаҳои нарм, эндокардит, пневмония, остеомиелит, бактериемия ва сепсисро ба вуҷуд орад. Он тақрибан 500,000 дар беморхона бистарӣ мешавад (3, 4). Staphylococcus aureus инчунин боиси беморињои чорво (5) ва хояндаҳо (6) мегардад. Ин штаммҳои марбут ба ҳайвонот аз одамон пайдо шудаанд, аммо хусусиятҳои нави хоси мизбони ҳайвоноти худро пайдо кардаанд ва дар баъзе мавридҳо, функсияҳои генҳои марбут ба патогенези инсонро гум кардаанд (7).
Агар дар вояи баланд таъин карда шаванд, изолятҳои аз ҷиҳати клиникӣ мувофиқи Staphylococcus aureus метавонад дар мушҳо тавассути якчанд роҳҳои сироят боиси беморӣ шаванд. Тадқиқотҳои зиёде оид ба сирояти Staphylococcus aureus бо истифода аз моделҳои муш гузаронида шуданд. Бо вуҷуди ин, ин моделҳо наметавонанд бемориҳои инсониро ба таври комил тақлид кунанд (8). Ҳарчанд он то имрӯз дар моделҳои пеш аз клиникии мурғ самаранокии худро нишон дода бошад ҳам, ҳама озмоишҳои клиникии ваксинаҳои зидди Staphylococcus aureus то ба ҳол ноком шуданд. Ин далел метавонад ин номувофиқатиро беҳтар шарҳ диҳад. Камбудињои ин моделњоро, ки беморињоеро, ки аз штаммњои мутобикшудаи инсон ба вуљуд омадаанд, ќисман бо хусусияти намудњои шумораи зиёди омилњои вирулентии Staphylococcus aureus шарњ додан мумкин аст (8, 9). Яке аз чунин омилҳо ду компоненти порогени LukAB мебошад (9, 10) [инчунин бо номи LukGH (11) маълум аст]. Пас аз он ки LukAB ба ресептори CD11b (як ҷузъи интегрини αMβ2 (инчунин бо номи MAC-1 ва CR3 маълум аст)) пайваст мешавад, он фагоцитози инсонро тавассути ташкили сӯрохиҳо (10, 11) дар ҳуҷайраи мембранаи ҳуҷайра (12) ҳадаф қарор медиҳад ва мекушад. Махсусан, LukAB ба домени I CD11b бо наздикии баланд пайваст мешавад (12). LukAB ҳангоми сирояти инсон тавлид мешавад (13), дар зиёда аз 99% изолятҳои пайдарпайи Staphylococcus aureus пайдо шудааст (14) ва барои сирояти in vitro ба метициллин ҳассос ва ба метициллин муқовимат S-давраи куштори фагоситҳои мурдаи инсон масъул аст. . Изолятҳои Staphylococcus aureus (мутаносибан MSSA ва MRSA) (10, 11). Аз ин рӯ, LukAB як омили асосии вирулентӣ барои сабук кардани аксуламали иммунии мизбон ва ҳадафҳои эҳтимолии маводи мухаддир ҳисобида мешавад. Бо вуҷуди ин, LukAB дар ҳуҷайраҳои мурғ фаъолияти паст дорад (12, 15), ки ба омӯзиши in vivo оид ба патогенези токсин дар Staphylococcus aureus халал мерасонад. Муқовимат ба LukAB-ро метавон бо пайвастшавии камдаромади LukAB ба домени мурин CD11b I, сарфи назар аз он ки 78% аминокислотаҳо бо домени I инсон алоқаманданд, шарҳ дод (12).
Дар ин ҷо, мо тасмим гирифтем, ки паҳнои тропизми намудҳои LukAB-ро таҳлил кунем ва ин маълумотро барои тавлиди модели ҳассос истифода барем. Мо пайвастшавии LukAB-ро ба домени CD11b I аз ширхӯрони гуногун тафтиш кардем ва ин маълумотро бо таҳлили эволютсионии домени CD11b I дар приматҳо ва хояндаҳо якҷоя кардем. Муносибати иловагии мо нишон дод, ки пасмондаҳо хусусиятҳои интихоби такрории мусбӣ, аз ҷумла боқимондаҳоеро, ки дар пайвастшавии LukAB иштирок мекунанд, нишон медиҳанд. Бо истифода аз як қатор химераҳои домени I, мо 11 минтақаи аминокислотаҳои домени I инсонро муайян кардем, ки барои пайвастани LukAB муҳиманд. Бо ин дониш муҷаҳҳаз карда, мо геноми муриро таҳрир кардем, то минтақаи башаргардонидашудаи LukAB-ро дар домени CD11b I рамзгузорӣ кунад. Пас аз сирояти мушҳои инсонӣ бо MRSA ба таври вобаста ба LukAB, онҳо ҳассосияти баландтари сироят ва бори бактерияро нишон доданд. Аз ин рӯ, бо омезиши филогения, биохимия ва муҳандисии генетикӣ, мо нақши омилҳои вирулентии хоси инсонро дар патофизиологияи сирояти Staphylococcus aureus дар системаи нави модели муш муқаррар кардем.
Таҳқиқоти қаблӣ нишон доданд, ки LukAB метавонад ба таври муассир нейтрофилҳоро дар одамон ва маймунҳои синомолгус ҳадаф қарор диҳад. Аммо, LukAB ба нейтрофилҳои харгӯш бо наздикии камтар нигаронида шудааст, ки аз EC50 (консентратсияи миёна самараноки) он шаҳодат медиҳад, ки аз ҳуҷайраҳои инсон тақрибан 100 маротиба зиёдтар аст, дар ҳоле ки барои мушҳое, ки наздикии камтар доранд, EC50 аз ҳуҷайраҳои инсон 2000 маротиба зиёдтар аст (15)) . Ин натиҷаҳо бо таҳқиқоте мувофиқанд, ки LukAB ба доменҳои рекомбинатии инсон I пайвасти баланд дорад, дар ҳоле ки пайвасти он ба доменҳои рекомбинати муш I заиф ё номуайян аст (12). Мо ин таҳқиқотро тавассути ифода ва тоза кардани доменҳои рекомбинати I аз ширхӯрони гуногун васеъ мекунем (Расми 1, А ва В) ва тафтиши пайвастагии LukAB ба доменҳои рекомбинати I (Расми 1C). Тавре ки интизор мерафт, мо фаҳмидем, ки LukAB ба таври муассир ба домени I инсон ба таври қаноатбахш ва мушаххас мепайвандад. Баръакс, LukAB суст ба домени муш I ва суст ба домени харгӯш I дар сатҳи мӯътадил мепайвандад. Илова бар ин, мо дарёфтем, ки LukAB ба доменҳои I аспҳо, маймунҳои резус ва хукҳо сахт мепайвандад ва пайвастшавӣ ба доменҳои I инсонро инъикос мекунад (Расми 1C). Усули ҳатмии LukAB ба домени каламуш I ба пайванди мобайнӣ ба домени харгӯш I монанд аст, дар ҳоле ки пайвастшавӣ ба домени I-и хомякҳо, гӯсфандон ва говҳои чинӣ қариб ғайриимкон аст (расми 1С). Домени I, ки ба LukAB сахт пайваст аст, бо домени I инсон >80% гомология дорад, дар ҳоле ки домени I бо домени I инсонӣ танҳо 80% ҳамбастагии заиф ё миёнаро нишон медиҳад (Расми 1D).
$A) Дарахти филогенетикї дар асоси пайдарпаии аминокислотаи домени CD11b I намудњои гуногун ва фоизи яксон будани аминокислотаҳо бо домени I инсон. (B) Рангкунии Coomassie аз 1 мкг доменҳои LukAB ва I. (C) Тавре ки чен карда шудааст, пайвастшавии LukAB ба домени рекомбинатсияи I намудҳое, ки дар (A) баррасӣ шудаанд. Маълумот то ҳадди максималии ҷаббида дар 450 нм LukAB ба домени I инсон пайваст карда шуд. Маълумот ҳамчун миёнаи ± SEM се таҷрибаи мустақил ифода карда мешавад. Дар муқоиса бо домени муш I, аҳамияти оморӣ тавассути таҳлили дутарафаи дисперсия муайян карда шуд (****P CD11b як ресептор барои зиёда аз 40 лигандҳои гуногун аст ва дар системаи иммунӣ нақши калидӣ мебозад. Мушҳои нокаут CD11b ҳассосияти сепсиси микробҳо (16) ва сироятҳои сершуморро зиёд кардаанд (17, 18). CD11b инчунин метавонад ҳамчун ҳадаф барои LukAB ва як қатор дигар микроорганизмҳо ва омилҳои микробӣ истифода шавад (12, 19-22). Аз ин рӯ, CD11b метавонад зери фишори интихобӣ бошад, то аз ҷониби омилҳои вирусӣ эътироф нашавад ва нақши калидии худро дар функсияи иммунӣ нигоҳ дорад.
Барои тафтиши эволютсияи CD11b, мо таҳлили филогенетикиро дар пайдарпаии аз намунаҳои 19 намуди приматҳои антропоморфӣ (Ҷадвали S1) ва 13 намуди хояндаҳо (Ҷадвали S2) ҷамъоварӣ кардем. Мо эҳтимолияти иловагии максималии таҳлили филогенетикиро истифода мебарем [таҳлили физикӣ тавассути эҳтимолияти максималӣ (PAML)] ва Bayesian [HyPhy: Модели эволютсионии эффектҳои омехта (MEME) ва наздикшавии Fast Unbiased Bayes (FUBAR)] Он барои ҳисоб кардани таносуби ғайримуқаррарӣ амалӣ карда мешавад. Меъёрҳои синонимӣ ва синоними ивазкунӣ (dN / dS) барои ҳар як мавқеъ дар пайдарпаии рамзгузории CD11b. Дар табақаҳои приматҳо ва хояндаҳо, афзоиши назарраси арзишҳои dN / dS барои боқимондаҳои сершумор дар CD11b (Расми 2A) (Ҷадвали S3) мушоҳида шудааст. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки ITGAM (гени рамзгузории CD11b) аз интихоби мусбати такрорӣ гузаштааст, ки бисёр омилҳои хоси иммунии модарзодиро ба ёд меорад (23, 24). Сайтҳое, ки аз интихоби мусбӣ мегузаранд, асосан дар домени CD11b I мутамарказ шудаанд (Расми 2А), ки ба лигандҳои эндогенӣ ва LukAB мепайвандад (25).
(A) Сайтҳое, ки интихоби эпизодӣ (MEME ва PAML) ва гузаранда (FUBAR) дар CD11b-и пурра бо секунҷаҳо нишон дода шудаанд. (B) Сохтори домени I инсон [Маълумоти маълумотҳои сафеда (PDB) ID: 1IDO]. Боқимондаҳо хусусиятҳои интихоби мусбатро дар се алгоритми мустақил нишон доданд [FUBAR (P> 0.9); PAML (M7 бар зидди M8, P≤0,05); MEME (P≤0.05)] ҳамчун сфера нишон дода шуданд ва қайд карда шуданд. (C то E) Пайвастагии LukAB ба мутантҳои домени I (C) ва доменҳои I аз приматҳои гуногун (D) ва хояндаҳо (E) чен карда шуд. Маълумот то ҳадди максималии ҷаббида дар 450 нм LukAB ба домени I инсон пайваст карда шуд. Маълумот ҳамчун миёнаи ± SEM се таҷрибаи мустақил ифода карда мешавад. Ањамияти оморї тавассути тањлили дутарафаи дисперсия муайян карда шуд (**** Р Мо фарзия кардем, ки имзои интихобии мусбати сайтҳо дар доираи домени CD11b I метавонад аз таъсири мутақобила бо омилҳои вирулентие, ки аз ҷониби патогенҳо, аз ҷумла LukAB тавлид мешаванд, сурат гирад. Дар табақаҳои маймунҳо ва хояндаҳо, мавқеъҳои аминокислотаҳо 164, 222 ва 294 хусусиятҳои муштараки интихоби универсалии мусбатро дар се таҳлили мустақил (PAML, MEME ва FUBAR) нишон доданд (Расми 2B). Барои муайян кардани он, ки оё тағирёбии аминокислотаҳо дар ин мавқеъ ба таъсири мутақобилаи байни CD11b ва LukAB таъсир мерасонанд, мо ин пасмондаҳоро байни доменҳои инсон ва муш I мутатсия кардем (Расми S1A). Дар муқоиса бо домени I инсон, мутатсияи кислотаи глутамикӣ (E294) дар мавқеи 294 дар одамон ба пролин (боқимондаи муш) ё лизин (бақияи асосӣ) боиси коҳиши назарраси пайвастагии LukAB гардид. Аммо, мутатсия кардани пролин дар мавқеъи 294 дар домени I ба кислотаи глутамикӣ (P294E) боиси афзоиши пайвастагии LukAB нагардид, ки ин нишон медиҳад, ки пайвасти LukAB дигар пасмондаҳоро дар домени I инсон талаб мекунад. Мутацияи гистидин дар мавқеи 164 ва лейцин дар мавқеи 222 ба боқимондаи мурин (H164IL222N) ба пайвастшавии LukAB ба домени I инсон таъсир нарасонд. Пайвастагии LukAB ба домени I инсон (ҳамаи се пасмондаҳо ба боқимондаҳои мурғ мутататсия шудаанд) ба E294P ва E294K шабеҳанд ва минбаъд тасдиқ мекунанд, ки боқимондаҳои 164 ва 222 метавонанд дар таъсири мутақобилаи токсинҳо ва ретсепторҳо иштирок накунанд, аммо метавонанд Муомиларо бо дигар CD11b- инъикос кунанд. патогенҳо.
Баъдан, мо пайвастшавии домени I-и дигар приматҳоро, ки ба таҳлили мо дохил карда шудаанд, тафтиш кардем ва аз рамзҳои аминокислотаи инсон дар мавқеъҳои 164, 222 ва 294 фарқ мекарданд. Сарфи назар аз гомологияи баланд бо домени I инсон (89%), домени I аз колобуси Ангола кам шудани пайвастшавиро ба LukAB нишон дод (Расми 2, D то F). Ин пайванди камшударо бо он шарҳ додан мумкин аст, ки домени I дорои лейцин дар мавқеи 294 (расми 2, D то F). Баръакс, маймуни бинии тиллоӣ низ дар ин мавқеъ лейцин дорад, аммо пайвастани ЛукАБ ба домени инсонии I ва пайвастани домени I. Аз ин рӯ, ин бозёфтҳо саҳми якҷояи сайтҳоеро, ки LukAB мепайвандад, пешниҳод мекунанд.
Мо инчунин пайвастшавии LukAB-ро ба домени I хояндаҳои дигар тафтиш кардем. Мо дарёфтем, ки каламуши Кенгуру I-и Орд дар муқоиса бо домени мури I (расми 2E) пайвастагии бузург нишон дод. Домени каламуши кенгуру I аз Орд дорои кислотаи глутамикӣ дар мавқеи 294 мебошад, ки бо домени I инсон нигоҳ дошта мешавад. Доираи атрофи сайт инчунин одамонро хеле муҳофизат мекунад. Мо фарзия кардем, ки ин ҳалқа барои пайваст кардани LukAB ба домени I каламуши кенгуру Орд хеле муҳим аст, гарчанде ки шахсияти умумии аминокислотаҳо байни ин домени I ва домени I инсон танҳо 78% аст (Расми 2F).
Якҷоя, ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки ITGAM як қатор интихоби мусбатро дар пасмондаҳои интихобшуда паси сар кардааст (хусусан дар домени I). Мо сайти 294-ро ҳамчун як сайт муайян кардем, ки барои бастани LukAB муҳим аст.
Барои тақсими минбаъдаи интерфейси ҳатмии LukAB дар домени CD11b I, мо пайдарпайии аминокислотаҳои доменҳои инсон ва муш I-ро муқоиса кардем (Расми 3A) ва аминокислотаҳои гуногунро дар сохтори домени I инсон харита кардем (26). Мо дарёфтем, ки аксари аминокислотаҳои гуногун дар сатҳи рӯизаминӣ қарор доранд (Расми 3B). Аз рӯи мавқеъ дар домени I мо аминокислотаҳои гуногунро ба 7 гурӯҳ тақсим мекунем (расми 3, А ва В). Доменҳои рекомбинантии химерикии I (химераҳои HMH), ки дорои пасмондаҳои мурғ аз ҳар як ҳафт гурӯҳ дар шоҳроҳи домени I инсонанд, тавлид ва барои омӯзиши ҳатмӣ истифода шуданд (Расми S2, A ва B). LukAB бо химераҳои HMH 1 то 6 дар сатҳе, ки ба доменҳои навъи ваҳшӣ (WT) инсони I мепайвандад (расми 3С). Баръакси ин, пайвастагии LukAB ба HMH chimera 7 заиф аст.
(A) Ҳамоҳангсозии аминокислотаҳои доменҳои I муш ва инсон. Кислотаҳои гуногуни аминокислотаҳо таъкид карда мешаванд. Ҳар як ранг химераи дигари домени I-ро ифода мекунад. (B) Сохтори домени I инсон (ID PDB: 1IDO). Минтақаи ҳифзшудаи домени муш I бо ранги хокистарӣ ва ранги минтақаи дивергент дар (A) нишон дода шудааст. (C ба E) LukAB ба инсон, муш, химераи HMH (боқимондаҳои муш дар сутуни домени I инсон) (C то E) ва химераи MHM (боқимондаҳои инсон дар сутуни домени I муш) (D ва E) I-домен мепайвандад. . HMH 7289-316 ва MHM 7289-316 мутаносибан HMH 7 ва MHM 7-ро дар (C ва D) (E) нишон медиҳанд. Маълумот то ҳадди максималии ҷаббида дар 450 нм LukAB ба домени I инсон пайваст карда шуд. Маълумот ҳамчун миёнаи ± SEM се таҷрибаи мустақил ифода карда мешавад. Дар муқоиса бо домени инсон (C) ё муш (D) I, аҳамияти оморӣ бо ANOVA дутарафа муайян карда шуд (**** P Мо инчунин як таҷрибаи баръакс анҷом додем, ки дар он ҳамон аминокислотаҳо ба боқимондаҳои инсон дар сутуни домени муш I (химераи MHM) мутация шуданд. Гарчанде ки пайвастагии LukAB ба химераҳои MHM 1 то 6 заиф аст, сатҳи ҳатмии токсин ба MHM 7 ба домени I инсон монанд аст (Расми 2D). Аз ин рӯ, минтақаи 7, ки аминокислотаҳои аз 289 то 316 дорад, барои пайвастани LukAB ба домени I инсон зарур аст ва барои мувофиқ кардани домени I мурин бо пайвасти LukAB кифоя аст. Бояд қайд кард, ки глутамат 294 дар ин минтақа ҷойгир аст, ки минбаъд аҳамияти ин пасмондаро дар ҳамкории домени LukAB/I дастгирӣ мекунад.
Кислотаҳои аминокислотаҳо дар Химера 7 ҳалқа ва қисми сохтори спиралиро фаро мегиранд ва ба макони пайвастшавӣ аз металл вобаста (MIDAS) -и домени I наздиканд. Катионҳои дувалентӣ дар ин макон барои пайвастани аксари лигандҳои эндогении CD11b муҳим аст (27) ва ин минтақа инчунин метавонад барои пайвастшавии LukAB муҳим бошад. Аз ин рӯ, мо минбаъд кӯшиш кардем, ки минтақаи ҳатмии LukAB-ро дар домени CD11b I боз ҳам кам кунем. Пас аз санҷиши дигар химераҳо ва баррасии боқимондаҳои хурдтар дар Chimera 7, мо дарёфтем, ки химера бо шоҳроҳи домени Muridae I танҳо боқимондаҳои аз 292 то 295 (MHM 7292–295) инсонӣ карда шудааст (Расми 3E) Дар якҷоягӣ бо LukAB мувофиқ аст. Монанд ба роҳи домени инсонии I ва дарозии пурраи MHM 7 (MHM 7289-316). Илова бар ин, агар мо ҳар як боқимондаи мутатсияшудаи дигарро дар MHM 7 тағир диҳем, ба истиснои боқимондаҳои 292 то 295 пайдарпаии инсон дар шоҳроҳи домени I муш (MHM 7289, 298-316), LukAB суст пайваст мешавад ва ба сохтори муш I мепайвандад. Доменҳо монанданд.
Барои тавсеаи минбаъдаи маълумоти таҳлили иммуносорбенти бо фермент алоқаманд (ELISA), мо резонанси сатҳи плазмониро (SPR) барои чен кардани кинетикаи ҳатмии LukAB бо химераҳои калидӣ анҷом додем (Ҷадвали 1). Мо дарёфтем, ки константаи диссотсиатсияи (KD) домени I инсон 39,29 нМ аст, дар ҳоле ки KD домени муш I дар 246,6 мкМ бузургӣ аз 6000 маротиба зиёдтар аст. КД-и химераи якчояи мо MHM 7 69,60 нМ мебошад, ки ин назар ба домени одами I 1,7 баробар зиёд аст. Баръакси ин, KD-и MHM 7292-295 173,98 нм аст, ки аз домени I инсон 4,4 маротиба калонтар аст, ки ин нишон медиҳад, ки пасмондаҳои ғайр аз ҳалқаи 292-295 дар химераи MHM 7 низ ба пайвастани токсинҳо мусоидат мекунанд.
Тадқиқотҳои дар боло зикршуда муайян карданд, ки боқимондаҳои инсонӣ аз 289 то 316 кифояанд, то домени мурин I покшуда бо ҳатмии LukAB мувофиқ бошанд. Баъдан, мо мехоҳем муайян кунем, ки оё ворид кардани боқимондаҳои инсон аз 289 то 316 ба дарозии пурраи мурин CD11b метавонад ресепторро бо ҳатмии токсинҳо мувофиқ созад. Плазмид барои трансфексияи гурдаи ҷанинии инсон (HEK) 293T истифода шуд, то як CD11b-и муринро рамзгузорӣ кунад, ки дорои тамоми домени I инсон ё MHM 7 химерикии I ва CD18 (Расми S2C) мебошад. Ҳарчанд ифодаи CD11b/CD18-и инсон ҳуҷайраро бо ҳатмии LukAB мувофиқ сохт, ифодаи CD11b/CD18 мурин набуд ва ҳамин тавр тамоми таҳлили ҳатмии ҳуҷайраро тасдиқ кард. Мо дарёфтем, ки LukAB метавонад ба ҳуҷайраҳое пайваст шавад, ки CD11b-и гуманонидашуда тавлид мекунанд, ки дорои пайдарпаии WT домени I инсон ё 11 боқимондаи инсон дар MHM 7 мебошад (Расми 3G). Аз ин рӯ, домени ҳатмии LukAB дар мурини инсонии CD11b ҳуҷайраи мизбонро бо ҳатмии LukAB мувофиқ месозад.
Афзоиши назарраси пайвастшавии LukAB, ки дар химераи MHM 7 мушоҳида шудааст, моро водор кард, ки баҳо диҳем, ки оё ин минтақаро дар мушҳо метавон гуманизатсия кард. Murine Itgam як гени калонест, ки 55,852 нуклеотид ва 30 экзон дорад. Хушбахтона, минтақае, ки дар ин ҷо барои пайвастшавии LukAB муҳим аст, танҳо бо экзони 9 рамзгузорӣ шудааст. Мо CRISPR-Cas9 (28)-ро барои таҳрири экзон 9, ки боқимондаҳои инсониро аз 289 то 316 рамзгузорӣ мекунад (расми 4А ва расми S3A) истифода бурдем. Мушҳои "хуманизатсияшудаи CD11b" (мушҳои hCD11b) истеҳсол карда шуданд ва пайдо шуданд, ки намуди зоҳирӣ, қобилияти репродуктивӣ, қобилият ва вазъи саломатии онҳо муқаррарӣ буданд.
(A) Диаграммаи схематикии локуси мурғи Итгам ва қолаби ДНК, ки барои гуманизатсия кардани экзони 9 истифода мешавад. (B ба D) CD11b, F4/80 ва MHC II аз iBMDMs аз мушҳои WT ва hCD11b рангубор карда шуда, тавассути цитометрияи ҷараён баҳо дода шуданд (B). (C) WT ва hCD11b iBMDM бо хунобаи GFP тавлидкунандаи Staphylococcus aureus ± инкубатсия карда шуданд ва фагоцитоз бо цитометрияи ҷараён ҳамчун% аз iBMDM-ҳои GFP-мусбат чен карда шуд. Маълумот ҳамчун миёнаи се таҷрибаҳои мустақил, ки дар такрори ±SEM анҷом дода шудаанд, ифода карда мешаванд. (D ва E) WT ва hCD11b iBMDM (D) ва ҳуҷайраҳои экссудатии перитонеалӣ (E) бо LukAB-и биотинилшуда инкубатсия карда шуданд ва LukAB-и пайвастшуда тавассути цитометрияи ҷараён муайян карда шуд. Маълумот ҳамчун миёнаи се таҷрибаҳои мустақил, ки дар такрори ±SEM анҷом дода шудаанд, ифода карда мешаванд. Ахамияти статистикй бо рохи тахлили дутарафаи дисперсия муайян карда шуд (**** Р Барои тавсифи ин мушҳо, мо аввал ҳуҷайраҳои мағзи устухонро аз мушҳои hCD11b ва WT ҷамъоварӣ кардем ва макрофагҳои ҷовидонии мағзи устухонро (iBMDM) тавлид кардем (29). Муайян карда шуд, ки iBMDM аз мушҳои WT ва hCD11b дар сатҳи худ сатҳи якхелаи CD11b, F4/80 ва комплекси асосии гистомутобиқатии (MHC) синфи II доранд (Расми 4B). Илова бар ин, ҳуҷайраҳои hCD11b метавонанд протеини сабзи флуоресцентиро (GFP) Staphylococcus aureus-ро ҳам дар фагоцитоз ва ҳам фагоцитози ғайрифагоцитози хуноба, ки ба WT-и ваҳшӣ монанданд, фагоцитоз кунанд (Тасвири 4C). Аз ин рӯ, чунин ба назар мерасад, ки мушҳои hCD11b функсияҳо ё сатҳи ифодаи аз CD11b вобастаро комилан тағир намедиҳанд.
Баъдан, пайвастагии LukAB ба iBMDM аз мушҳои WT ва hCD11b чен карда шуд. Мутобиқи омӯзиши тамоми ҳуҷайраҳои HEK293T (Расми 3G), мо мушоҳида кардем, ки LukAB ба ҳуҷайраҳои муши hCD11b мепайвандад, аммо бо ҳуҷайраҳои муши WT суст мепайвандад (Расми 4D). Барои тасдиқи ин маълумот, мо мутақобилаи байни LukAB ва iBMDM мурринро бо истифода аз SPR тамоми ҳуҷайра чен кардем. Муносибати iBMDM, ки hCD11b-ро ифода мекунад, нисбат ба iBMDM, ки WT CD11b-ро ифода мекунад, бо KD 187,7 nM 13 маротиба зиёдтар аст (Расми S3B).
Минбаъд, мо бо истифода аз ҳуҷайраҳои экссудати перитонеалии ба тозагӣ ҷудошуда мо дигар таҳқиқоти функсионалӣ анҷом додем. Дар муқоиса бо мушҳои WT, мо пайвастагии беҳтаршудаи ҳуҷайраҳоро аз мушҳои hCD11b мушоҳида кардем (Расми 4E). Қобили зикр аст, ки афзоиши пайвастагии LukAB мустақиман ба осеби мембранаи экссудативии ҳуҷайраҳои перитонеалии hCD11b бо токсин алоқаманд аст (Расми 4F). Ҳуҷайраҳои экссудивии перитонеалӣ дорои як қатор ҳуҷайраҳои сафеди хуни CD11b мебошанд, аз ҷумла нейтрофилҳои полиморфонунуклеарӣ (PMN), макрофагҳо, моноцитҳо ва ҳуҷайраҳои дендритикӣ (DC). Барои муайян кардани ҳадафи LukAB, мо секрецияҳои ибтидоии перитонеалии мурии мушҳоро аз мушҳои hCD11b бо токсинҳо коркард кардем ва таҳлили бисёрпараметрии цитометрии ҷараёнро анҷом додем. Ин тадқиқотҳо нишон медиҳанд, ки PMN лейкоситест, ки асосан ба осеби мембранаи LukAB, пас аз он моноцитҳо ва DC осебпазир аст (Расми 4G).
Баъдан, мо муайян кардем, ки оё мушҳои hCD11b ба сирояти дохиливаридии Staphylococcus aureus бештар ҳассосанд. Мо штамми MRSA LAC (Шаҳристони Лос-Анҷелес), ки намояндаи навъи электрофорези майдони набзи гели USA300 мебошад, истифода бурдем. Ин сабаби маъмултарини сироятҳои MRSA аз ҷониби ҷомеа ва як сабаби пайдоиши сироятҳои MRSA, ки бо беморхонаҳо дар Иёлоти Муттаҳида алоқаманд аст, мебошад. Давлат (30). Мушҳои мувофиқи синну сол WT ва hCD11b бо воҳидҳои колонияҳои 3 × 106 (CFU) аз USA300 ретро-орбиталӣ сироят карда шуданд ва сарбории бактериявӣ дар узвҳо 3 рӯз пас аз сироят тафтиш карда шуд. Дар ин муҳити таҷрибавӣ, танҳо тақрибан 30% мушҳои WT бори бактериявии ошкоршударо дар ҷигар нишон доданд. Баръакси ин, мушҳои hCD11b дар 86% мушҳо сарбории бактериявии муайяншаванда доранд, ки аз фенотипи LukAB вобаста аст (Расми 5А). Аз ин рӯ, гуманизатсияи CD11b монеаи сироятро, ки мушҳои WT нишон медиҳанд, коҳиш медиҳад. Бо тафтиши сарбории бактериявӣ дар узвҳо, мо дарёфтем, ки дар муқоиса бо мушҳои WT, афзоиши CFU дар ҷигари мушҳои hCD11b беш аз 1-лог буд (Расми 5B). Бояд қайд кард, ки дар бори бактериявии испурч, гурдаҳо, дил ва шушҳо фарқиятҳои аз ҷиҳати оморӣ муҳим набуданд ва дар талафоти вазн ё сатҳи зинда мондан фарқият вуҷуд надошт (Расми S4, A ва B). Фенотипи афзояндаи CFU, ки дар мушҳои hCD11b мушоҳида мешавад, инчунин аз LukAB вобаста аст, зеро мушҳои WT, ки бо фенотипи ΔlukABUSA300 сироят шудаанд, бо мушҳои WT USA300 ва hCD11b сироят шудаанд (Расми 5B).
(А ва В) Мушҳои WT ва hCD11b-ро ба дохили вена бо штамми WT USA300 LAC ё штамми сингении DelukABLAC ~3×106 CFU сироят кунед. Пас аз се рӯзи сироят, фоизи мушҳо бо CFU дар ҷигар муайян карда шуд (A). Аҳамияти оморӣ тавассути санҷиши хи-мураббаъ (** P Минбаъд, мо тавассути сироят кардани мушҳо бо 1 × 107 CFU аз ΔlukABUSA300 ё штамми изогенӣ, ки lukAB-ро дар плазмид ифода мекунад, таҳқиқоти комплементатсионӣ анҷом додем. Барои кам кардани талафоти плазмидҳои комплементарӣ, узвҳо 1 рӯз пас аз сироят ҷамъоварӣ карда шуданд. Ин тадқиқотҳо минбаъд исбот карданд, ки CFU-и ҷигари мушҳои hCD11b ба таври вобаста ба LukAB афзоиш ёфтааст (Тасвири 5C). Аз ин рӯ, CD11b башарият муқовимати мушҳоро ба сирояти хуни MRSA тавре коҳиш медиҳад, ки аз LukAB вобаста аст.
Мо фарзия кардем, ки афзоиши мушоҳидашудаи сарбории бактериявии хоси ҷигар метавонад аз сабаби танзими дифференсиалӣ/истеҳсоли LukAB дар бадан бошад. Барои ҳалли ин мушкилот, мо ELISA-ро таҳия кардем, то миқдори LukAB-ро дар бадан тавлид кунад. Як рӯз пас аз сироят, мо сатҳи LukAB-ро дар ҷигар ва гурдаҳо тафтиш кардем. Гарчанде ки бори бактериявӣ дар ин лаҳза муқоисашаванда буд (Расми 5D), мо тавонистем LukAB-ро дар ҷигари мушҳои сироятшуда муайян кунем, аммо на дар гурдаҳо (Тасвири 5E ва Расми S4, C ва D). Аз ин рӯ, дар муқоиса бо дигар узвҳо, LukAB дар ҷигар дар сатҳи баландтар тавлид мешавад ва яке аз аввалин узвҳоест, ки пас аз сирояти хун сироят шудааст (31), ки ба афзоиши сарбории бактериявӣ тавассути LukAB хоси ҷигар мусоидат мекунад. Шарҳҳои имконпазир.
Фенотипи мушаххаси бофтаро инчунин бо ҷалб ва/ё шумораи маҳаллии ҳуҷайраҳои ҳассос шарҳ додан мумкин аст. Азбаски PMN навъи асосии ҳуҷайраи hCD11b аст, ки ба сирояти LukAB ҳассос аст (Расми 4G), мо PMN-ро дар ҷигар ва гурдаи мушҳои назоратии сироятнашуда 1 рӯз пас аз сироят муайян кардем. Ин тадқиқотҳо нишон медиҳанд, ки дар муқоиса бо ҷигари сироятнашуда, ҳиссаи PMNs дар ҷигари сироятшуда дар 1 рӯзи пас аз сироят зиёда аз 10 маротиба зиёд шудааст, дар ҳоле ки PMNs дар гурдаҳо дар ин вақт ҳанӯз хеле паст буданд (Расми 5F ва Расми S4). Якҷоя гирифта, ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки шумораи ҳуҷайраҳое, ки аз ҷониби LukAB ва LukAB мавриди ҳадаф қарор гирифтаанд, дар ҷигари аввали пас аз сироят афзоиш ёфта, барои афзоиши сарбории бактериявии бо миёнаравии LukAB ба бофтаи хос тавзеҳот медиҳанд.
Дар ин ҷо, мо детерминантҳои мушаххаси молекулавии аз ҷониби токсинҳои LukAB нишон додашударо муайян кардем ва ин маълумотро барои таъсиси модели мукаммали сирояти Staphylococcus aureus истифода кардем. Барои фаҳмидани он, ки чӣ тавр LukAB ба домени CD11b I инсон мепайвандад, аммо на ба домени муш I, мо аввал як равиши густурдаи генетикии эволютсиониро қабул кардем, ки ба фарқияти назарраси байни приматҳо ва хояндаҳо мушоҳида шудааст. . Мо дарёфтем, ки сайтҳои сершумор дар CD11b, махсусан дар домени I, хусусиятҳои интихоби универсалии мусбатро нишон доданд. Ин нишон медиҳад, ки ин маконҳо зери фишори сахт ва такрории интихобӣ қарор гирифтаанд, ки барои иваз кардан мусоид аст ва қобилияти муайян кардани микроорганизмҳоро коҳиш медиҳад. Азбаски ин сигналҳо аз тафовути приматҳои тақрибан 40 миллион сол ба даст омадаанд ва фосилаҳои эволютсионии якхела дар намунаи хояндаҳои мо доранд, зарур аст, ки натиҷаҳои интихоби микроорганизмҳои мушаххаси қадимиро дар тӯли муддати тӯлонӣ муайян кунед. Аммо, сайтҳои интихоби такрорӣ дар домени I бо ҳамкории такрорӣ бо патогенҳое, ки функсияҳои ба монанди LukAB-ро рамзгузорӣ мекунанд, мувофиқат мекунанд. Аз сабаби таъсири мутақобилаи натиҷаҳои эволютсионии гузашта, ин интихобҳои такрорӣ метавонанд намудҳои муосирро ба сироятҳои муосир тобовартар ё ҳассос гардонанд. Дар байни ин мавқеъҳо дар домени I, мо як боқимонда, кислотаи глутамиро дар мавқеи 294 (E294) муайян кардем, ки дар пайвастшавии LukAB нақш мебозад. Бо омӯхтани пасмондаҳо дар ин макон дар хояндаҳо, мо муайян кардем, ки каламуши кенгуру I-и Орд бо LukAB мувофиқ аст, гарчанде ки гомологияи умумии он бо домени I инсонӣ паст аст. Мо тахмин мезанем, ки ин ба пайдарпаии аминокислотаҳои кислотаи глутамикӣ дар мавқеи 294 ва ҳалқаи гирду атроф вобаста аст, ки бо одамон хеле мувофиқ аст. Аммо, E294 на танҳо барои бастани LukAB масъул аст. Бо истифода аз як қатор химераҳои I-домен, мо минтақаеро ёфтем, ки дорои 11 аминокислотаҳои дивергентӣ мебошанд, ки барои пайвастшавӣ заруранд. Иваз кардани ин минтақа бо пайдарпаии одам боиси пайвастагии баланди LukAB ба муш CD11b гардид.
Аз сабаби пайвастагии сусти LukAB ба муррин CD11b, саҳми ин токсин ба сирояти Staphylococcus aureus дар модели кунунии мурғ кам арзёбӣ мешавад. Барои бартараф кардани ин нуқсон, мо мушҳоеро тавлид кардем, ки дорои ретсептори мури CD11b мебошанд, ки барои нигоҳ доштани 11 аминокислотаҳои инсонӣ тарҳрезӣ шудаанд, ки барои пайваст кардани LukAB ба домени CD11b I инсон муҳиманд. Чунин ба назар мерасад, ки мушҳои hCD11b функсияи CD11b-ро халалдор накардаанд, ки ин метавонад аз он бошад, ки минтақае, ки мо мутатсия кардаем, хурд аст ва домен дар пайвастшавӣ ба дигар лигандҳои CD11b иштирок намекунад. Дар маҷмӯъ, маълумоти мо нишон медиҳанд, ки ин мушҳо ба сирояти MRSA бештар осебпазиранд. Сирояти WT USA300 ба WT мушҳо Сирояти фенотипии мушҳои ΔlukAB USA300 ба hCD11b таъкид мекунад, ки ҳассосияти дар ин ҷо тавсифшуда тавассути LukAB миёнаравӣ карда мешавад ва худи мушҳои hCD11b ба норасоии штаммҳои LukAB бештар осебпазир нестанд. Таъсири сирояти Staphylococcus aureus.
Мо дарёфтем, ки сарфи назар аз бори шабеҳи бактериявӣ 1 рӯз пас аз сирояти дохиливаридӣ, LukAB дар ҷигар дар муқоиса бо гурда дар сатҳи баланд истеҳсол мешавад. Илова бар ин, дар мушҳои hCD11b, PMN, ҳуҷайраи асосии фагоситикӣ, ки ба LukAB ҳассос аст, пас аз 1 рӯзи сироят дар ҷигар ба таври назаррас афзоиш ёфт, аммо дар гурдаи сироятшуда сатҳи паст боқӣ монд. Ин бозёфтҳо ба тадқиқотҳое, ки нишон медиҳанд, ки сарфи назар аз бори баланди бактериявӣ, ташаккули абсцесси гурда бо инфилтратсияи калони PMN бори аввал тақрибан 3 рӯз пас аз сирояти Staphylococcus aureus ба дохили вена мушоҳида шудааст (32). Баръакс, нишон дода шудааст, ки ҷигар дар сироятҳои дохиливаридии Staphylococcus aureus нақши калидӣ мебозад. Пас аз сироят, бактерияҳо зуд аз ҷониби ҳуҷайраҳои Купфер дар ҷигар ҷудо карда мешаванд ва ҳавзи бактериявӣ ташкил мекунанд (31). Дар ниҳоят, бактерияҳо гурезанд ва ба узвҳои дигар паҳн мешаванд, ё сироятро нигоҳ медорад. Якҷоя, ин метавонад фаҳмонад, ки чаро мо фенотипҳои вобаста ба LukAB-ро дар ҷигар дар шароити тафтишшуда мушоҳида мекунем, аммо на дар узвҳои дигар ба монанди гурда. Дар ҳузури Staphylococcus aureus, CD11b дар PMNs боло танзим карда шуд (33), дар ҳоле ки дар ҳузури PMNs, LukAB боло танзим карда шуд (34). Аз ин рӯ, мизбон ба мавҷудияти бактерияҳо тавассути ҷалби PMN бо сатҳи баланди CD11b посух медиҳад, аммо бактерияҳо бактерияҳоро тавассути тавлиди LukAB барои зарар ба ин ҳуҷайраҳо истифода мебаранд.
Дар ин ҷо, мо махсусан модели сирояти хунро тавсиф мекунем. Аммо, Staphylococcus aureus барои бемориҳои гуногун масъул аст ва нақши LukAB бояд дар моделҳои дигар тавсиф карда шавад (масалан, сироятҳои пӯст, пневмония, остеомиелит, сироятҳои марбут ба дастгоҳ ва ғайра). Дар оянда, муайян кардани он ки оё ин фенотипи ҷигар аз макони сироят вобаста аст, ҷолиб хоҳад буд.
LukAB яке аз омилҳои вирусии Staphylococcus aureus мебошад, ки тропизми инсонро нишон медиҳанд. Мо дар ин ҷо харитаи роҳро гузориш медиҳем, ки нишон медиҳад, ки чӣ гуна омезиши таҳқиқоти эволютсионалӣ бо биохимия ва муҳандисии генетикӣ метавонад дар vivo таҳқиқоти мутақобилаи хоси мизбон ва патогенро осон кунад. Бо гуманизатсия ё нобуд кардани ҳадафҳои мушаххаси инсон, тавлид кардани моделҳои мукаммали муш, ки ба сироятҳои инсон бештар тақлид мекунанд, имконпазир бошад. Ин моделҳо инчунин барои арзёбии таъсири тадқиқоти зидди S кӯмак хоҳанд кард. Табобати Staphylococcus aureus барои омилҳои вирулентии қаблан санҷиданашуда тарҳрезӣ шуда, қобилияти моро барои муайян кардани ҳадафҳои мувофиқ барои истеҳсоли антителоҳои зидди S хеле зарурӣ беҳтар мекунад. Агенти зарди тиллоӣ.
Ҳама таҷрибаҳо бо ҳайвонот аз ҷониби Кумитаи институтсионалии нигоҳубин ва истифодаи ҳайвоноти Донишгоҳи Ню Йорк баррасӣ ва тасдиқ карда шудаанд ва мувофиқи дастурҳои Институтҳои Миллии Тандурустӣ (NIH), Санади ҳифзи ҳайвонот ва қонуни федералии Иёлоти Муттаҳида гузаронида мешаванд.
E. coli DH5a дар тартиби клонкунӣ истифода шудааст. E. coli T7 LysY / LacQ барои ифодаи домени CD11b I тегҳои FLAG инсон истифода мешавад. Ҳама штаммҳои E. coli дар шўрбои Luria-Bertani (LB) парвариш карда мешаванд.
Штамҳои Staphylococcus aureus, ки дар ин тадқиқот истифода мешаванд, дар ҷадвали S4 оварда шудаанд. Барои экспрессияи сафедаи рекомбинантӣ ва омӯзиши сироят, штаммҳои Staphylococcus aureus ба колонияҳои ягона дар плитаҳои Tryptic Soy Agar (TSA) тақсим карда шуданд. Як колония дар шўрбои сояи триптӣ (TSB) васл карда шуд ва як шабонарӯз парвариш карда шуд ва сипас дар TSB дар соати 1:100 барои 3 соат субкультуратсия карда шуд.
Домени ман аз ITGAM-и инсонӣ (NM_001145808.1) ва мурин Itgam (NM_001082960.1), инчунин сайти 5'Nde I, пайвандгари 3'6-глицин, теги 3'3 × FLAG, сайти 3'Xho I, gBlocks порчаи ген аз Технологияи Integrated DNA (IDT) мутатсияҳои заруриро тавлид кард (Ҷадвали S6) ва бо истифода аз усулҳои стандартии клонкунӣ ба pET15b клон карда шуд. Тавре ки қаблан тавсиф шуда буд (12), плазмид ба E. coli T7 LysY/LacQ табдил ёфт ва тоза карда шуд. Хулоса, штамм дар шўрбои LB, ки бо ампициллин (100мкг/мл) дар 37°C ва 180 rpm ба OD600 (зичии оптикӣ дар 600 нм) 0,5 илова карда шудааст, парвариш карда шуд ва сипас 1 мМ изопропил β-d-1-ро истифода бурд. индуксияи тиогалактопиранозид (IPTG) барои 3 соат. Бактерияҳо бо буфери xTracter (Clontech), ки бо ингибитори протеаза (Рош), лизоцим (1 мг/мл) ва нуклеазаи бензой (Сигма) дар консентратсияи 3 У/мл илова карда шудаанд, лиз карда шуданд. Лизатро бо қатрони кислотаи никел-трифтортриастикӣ (NTA) инкубатсия кунед, бишӯед ва теги гистидинро илова кунед. Домени I бо 500 мм имидазол элюта карда мешавад. Протеини тозашуда дар 1x трис-буферии шӯр (TBS) + 10% глицерол дар 4°C шабона диализ карда шуд ва сипас дар -80°C нигоҳ дошта шуд.
Тавре ки дар боло зикр гардид (34), LukAB бо теги 5'6x-гистидин аз Staphylococcus aureus якҷоя тоза карда шуд (Ҷадвали S4). Хулоса, штамм дар TSB дорои хлорамфеникол (10мкг / мл) дар 37 ° C ва 180 rpm барои 5 соат то он даме, ки OD600 тақрибан 1,5 буд (1 × 109 CFU / мл) парвариш карда шуд. Пас аз он, бактерияҳо боришот мешаванд ва супернатант ҷамъоварӣ ва филтр карда мешавад. Қатрони NTA (Qiagen) бо супернатанти фарҳанг инкубатсия карда шуд, шуста ва бо имидазоли 500 мм элюта карда шуд. Протеин шабона дар 4°С дар 1x TBS ва 10% глицерол диализ карда шуд ва сипас дар -80°С нигоҳ дошта шуд.
Домени рекомбинати I (10 мкг/мл) дар чоҳҳои пластини 96-чоҳи Immulon 2HB дар шӯри фосфати буферӣ (PBS) дар як шабонарӯз дар 4 ° C фаро гирифта шуд. Чоҳҳо бо буфери соркунанда баста шуданд (2% шири хушк, 0,9% NaCl, 0,05% Tween 20, PBS), шуста ва бо консентратсияи муайяншудаи LukAB дар буфери соркунанда дар ҳарорати хонагӣ дар шароити ларзиш 30 инкубатор карда шуданд. дақиқа. Чойҳоро бишӯед ва бо антиденои поликлоналии харгӯш зидди ЛукА дар маҳлули 1:3000 барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ, дар ҳарорати хона ларзиш кунед. Баъдан, чоҳҳо шуста ва бо пероксидазаи зидди харгӯш (HRP) дар сатҳи 1:2500 дар ҳарорати хонагӣ барои 1 соат бо ларзиш инкубатсия карда шуданд. Чоҳҳоро бишӯед ва бо субстрати 100 мкл 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (TMB) барои 5 дақиқа инкубатсия кунед. Реаксия бо кислотаи сулфати 100 мкл қатъ карда шуд ва ҷаббида дар 450 нм чен карда шуд.
Ҷустуҷӯи BLAST-ро барои дарёфти пайдарпаии пурраи ДНК-и CD11b аз базаи маркази миллии иттилооти биотехнология (NCBI) истифода баред. Барои мувофиқ кардани ҳама пайдарпаии ДНК танзимоти пешфарзи MUSCLE -ро истифода баред. Барои нест кардани ҳама воридкунӣ, несткунӣ ва қатъ кардани кодонҳо пайдарпайро дастӣ буред. Таҳлили эволютсионӣ бо истифода аз файлҳои муқоисавии буридашуда ва дарахти навъҳои маҳдуд анҷом дода мешавад, ки муносибати эволютсионии маъмултаринро байни маймунҳо ва хояндаҳо ифода мекунад.
Хусусиятҳои интихобии мусбати бартарии эволютсионии маймунҳои бузург ва хояндаҳо алоҳида арзёбӣ карда шуданд. Файли ҳамоҳангсозии буридашуда ва дарахти филогенетикӣ ҳамчун файлҳои вурудӣ барои се бастаи нармафзори иловагӣ истифода мешаванд: PAML (v4.8, M7 ва M8) ва алгоритмҳои MEME ва FUBAR, ки тавассути бастаи нармафзори HyPhy дастрасанд. Сайтҳое, ки дар ҳар се алгоритми интихобӣ дорои хосиятҳои пароканда ва универсалии диверсификатсия шудаанд, номзадҳои боэътимод барои тавсифи минбаъдаи функсионалӣ ҳисобида мешаванд.
Антиденаҳои зерин истифода шуданд: антиденои поликлоналии харгӯш зидди ЛукА (10), иммуноглобулини буз зидди харгӯш G HRP (SC-2004), аллофикоцианин (APC) зидди муш/инсон CD11b, клон M1/70 (BioLegend, 101212); APC зидди муш F4/80, клони BM8 (BioLegend, 123115); APC-Cy7 зидди муш IA/IE, клон M5/114.15.2 (BioLegend, 107627); Фикоэритрин (PE)-Cy7 зидди муш/инсон CD11b, клон M1/70 (BioLegend, 101215); Fluorescein isothiocyanate (FITC) зидди муш Ly6G, клон 1A8 (BD Biosciences, 551460); APC зидди муш F4/80, клони BM8 (BioLegend, 123116); Momordica charantin протеини хлорофилл (PerCP) Cy5.5 зидди муш Ly6C, HK1.4 (BioLegend, 128011); BV421 зидди муш CD11c (BioLegend, 117329); V500 зидди муш/инсон CD11b, клон M1 / 70 (BD, 562128); PE-Cy7 зидди муш CD45, клон I3/2.3 (BioLegend, 147704); PE зидди муш Ly6G, клон 1A8 (BD, 551461); Зардоби поликлоналии харгӯш зидди ЛукА (35); Ва антиденои моноклоналии зидди LukAB.
Антиденои моноклоналии зидди LukAB аз ҷониби Envigo Inc. мувофиқи расмиёти стандартии амалиётии тасдиқшуда барои тавлиди ҳуҷайраҳои гибридомаи моноклоналии муш фармоиш дода шудааст. Хулоса, LukAB-и рекомбинантӣ (rLukAB) бо адъюванти пурраи Фрейд барои иммунизатсияи ибтидоӣ эмулсия карда мешавад ва сипас бо адъюванти нопурраи Фрейд эмулсия карда мешавад rLukAB барои иммунизатсияи пурқувват ва сипас бо адъюванти TiterMax rLukAB эмульсияшуда ё ду иммунизатсияи дигар мегузарад. Мушҳои эмкунӣ қурбонӣ карда шуданд, ҳуҷайраҳои испурч ҷамъоварӣ карда шуданд ва бо ҳуҷайраҳои миеломаи NS01 омехта карда шуданд, то гибридомаҳоро тавлид кунанд. Хатҳои ҳуҷайраи гибридомаи моноклоналӣ аз ҷониби ELISA интихоб карда шуданд.
Тавре ки қаблан зикр гардид, системаи Biacore T200 (GE) -ро барои идора кардани SPR бо тағиротҳои зерин истифода баред (12). Хулоса, маҷмӯаи сабти NHS-ро барои ислоҳ кардани доменҳои рекомбинати I (муш, инсон ва мутант) дар ҳуҷайраҳои ҷараёни 2 то 4-и силсилаи S чипи сенсори CM5 (GE) истифода баред ва ҳуҷайраи ҷараёни 1-ро ҳамчун холӣ ислоҳ кунед. Бо истифода аз кинетикаи як давра, LukAB дар ду партия дар панҷ диапазони консентратсияи аз 0,008 то 5 мкг/мл ва 0,16 то 100 мкг/мл анҷом дода шуд. Доираи оптималии ҳамкорӣ се маротиба гузаронида шуд. Буфери иҷрошудаи ҳама таҷрибаҳои SPR 1 × PBS бо рН 6,8 буд ва ҳамаи маълумотҳо бо истинодҳои дукарата тарҳ карда шуданд.
Мушҳои дувоздаҳҳафтаина бо CO2 эвтаниз карда шуданд, бо 70% этанол пошида шуданд ва сипас дар блоки пенофоли полистирол ҷойгир карда шуданд. Ҷамъоварии ҳуҷайраҳои мағзи устухони муш чунин аст. Пӯст ва мушакҳои пойҳои қафоро хориҷ кунед ва бо кайчи тези хушкида устухони ронро дар болои думҳо буред. Мушакҳои иловагиро хориҷ кунед, устухон ва устухонро ҷудо кунед ва дар хунобаи гови ҳомилаи 10% (FBS) дар табақи шаш-чоҳи рӯи ях ҷойгир кунед. Остеофитҳоро аз устухон хориҷ кунед ва мағзи устухонро бо 10 мл RPMI/10% FBS тоза кунед. Пас аз он мағзи устухон аз филтри ҳуҷайра гузаронида шуд ва бо боқимондаи муҳити атроф шуста шуд ва ҳуҷайраҳо бо центрифуга дар 1500 чархзанӣ барои 5 дақиқа ҷамъ карда шуданд. Барои хориҷ кардани ҳуҷайраҳои сурхи хун (РБК) ба ҳуҷайраҳои мағзи устухони нав ҷудошуда 2 мл буфери лизиси ACK (аммоний-хлор-калий) илова кунед ва дар ҳарорати хонагӣ барои 2 дақиқа инкубатсия кунед. Сипас буфери лизис бо илова кардани 10 мл муҳити RPMI безарар карда шуд ва ҳуҷайраҳо дар 1500 rpm барои 5 дақиқа центрифуга карда шуданд. Сипас ҳуҷайраҳо дар 10 мл RPMI/10% FBS дубора боздошта шуданд ва ҳисоб карда шуданд.
Ҳуҷайраҳои мағзи устухон (1 × 106) дар табақчаи петрии коркарднашудаи 10 см ва 30% супернатант L-929 (ATCC CCL-1) дар муҳити тағирёфтаи Eagle (DMEM) дар табақ петри ҷойгир карда шуданд. Дар рӯзи 3-юми дифференсия 5 мл муҳити иловагӣ илова кунед. Дар рӯзи 7-уми дифференсиатсияи макрофагҳо, супернатанти фибробластҳои J2 (Labaratories Kagan) (29) ҷамъоварӣ карда шуд ва бо филтри 0,45 мкм филтр карда шуд. BMDM дар 50% supernatant дар ҳолати J2 ва 50% supernatant L-929 барои 7 рӯз парвариш карда шуд ва дар рӯзи сеюм партияи нави омехтаи J2 ва L-929 илова карда шуд. Сипас 30% супернатанти L-929 илова кунед, то DMEM-ро то 90% омезед. Сипас 20% ҳуҷайраҳо ба муҳити дорои 25% супернатант L-929 интиқол дода шуданд. Пас аз ин тамоюл, дар давоми ҳар як гузариш, консентратсияи супернатанти L-929 дар DMEM солим 5% коҳиш меёбад, то даме ки BMDM дар DMEM бидуни супернатант L-929 ба таври муқаррарӣ афзоиш ёбад.
Ҳуҷайраҳои HEK293T ва iBMDMҳо дар 37 ° C бо 5% (в/в) CO2 дар DMEM нигоҳ дошта шуданд ва бо 10% (в/в) FBS ва пенициллин (100 U мл-1) ва стрептомицин (0,1 мг мл-1) илова карда шуданд. Агар тартиби дигаре гуфта нашуда бошад.
iBMDMs дар DMEM + 10% FBS + 1x пенициллин/стрептомицин парвариш карда мешаванд. Ҳуҷайраҳоро (2 × 105) дар табақи 96-чоҳи V-поён паҳн кунед, ду маротиба бо PBS бишӯед ва 25 мкл APC зидди муш/инсон CD11b, APC зидди муш F4/80 ё APC-Cy7 зидди мушро дар PBS истифода баред. 1: 300 маҳлули IA/IE ва блокатори Fc (BioLegend, 101320) 1:300 ҳал карда шуданд. Ҳуҷайраҳо дар тӯли 30 дақиқа дар ях ранг карда шуданд, ду маротиба бо PBS шуста шуданд ва дар 2% параформальдегид (PFA) дар PBS, 2% FBS аз гармӣ ва 0,5% азиди натрий собит карда шуданд. Барои ба даст овардани маълумотҳои цитометрии ҷараёни CytoFLEX (Beckman Coulter) ва барои таҳлили маълумот нармафзори FlowJo (TreeStar Inc.) истифода шуд.
Фарҳанги шабонарӯзии AH-LACUSA300-ΔlukABhlg::tet lukED::kan lukSF::spec-pOS1sGFP дар 1:100 дар TSB + хлорамфеникол (10 мкг/мл) субкультуратсия карда шуд ва то марҳилаи миёнаи логалӣ парвариш карда шуд. Бактерияҳоро бишӯед ва онҳоро дар муҳити фарҳангӣ дубора суспенд кунед ва то консентратсияи 5 × 107 CFU / мл об кунед. iBMDM-и омехта шуста шуд ва дар муҳити фарҳангӣ дар консентратсияи 5 × 105 ҳуҷайра / мл дубора боздошта шуд. 25 мкл бактерияҳои 5×107 CFU/мл ва зардоби миёна ё 2% мушро 50 мкл ба чоҳҳои табақи поёни 96-чоҳи U-шакл илова кунед ва дар давоми 1 дақиқа дар 37°С дар зери ларзиш пешакӣ инкубатсия кунед. 25 микролитр 5×105 iBMDM ба як миллилитр илова кунед ва дар 37°С бо ларзиш инкубатсия кунед. Дар вақти муайяншуда бо гузоштани намуна дар рӯи ях ва илова кардани 100 мкл буфери фиксатсияи флуорессенси фаъолшудаи ҳуҷайра (FACS) [PBS + 2% FBS + 2% PFA + 0,05% (w/v) азиди натрий] қатъ кунед. . Барои ба даст овардани маълумотҳои цитометрии ҷараёни CytoFLEX (Beckman Coulter) ва барои таҳлили маълумот нармафзори FlowJo (TreeStar Inc.) истифода шуд. Фагоцитоз муайян карда шуд, ки ҳуҷайраҳои мусбати %GFP мебошанд.
Плазмидҳои дар ин тадқиқот истифодашуда дар ҷадвали S5 оварда шудаанд. Бо истифода аз олигонуклеотидҳо дар Ҷадвали S6, муши pCMV6-Entry CD11b HI-domain ва pCMV6-Entry муши CD11b HMH 7-домен аз ҷониби FastCloning (36) клон карда шуданд (36) ва бо секвенсия тасдиқ карда шуданд.
Ҳуҷайраҳои HEK293T бо фосфати калсий бо плазмидҳои дар ҷадвали S6 номбаршуда трансфексия карда шуданд. Хулоса, 10 мкг/мл аз ҳар як плазмид ва 75 мкл 2,5M CaCl 2 ба оби деионизатсияшуда то ҳаҷми ниҳоии 750 мкл илова карда шуданд. Ҳангоми ҳаво додани омехта 750 микролитр намаки буферии 2х HEPES (HBS) [50 мм HEPES (pH 7.05), 280 мм NaCl ва 1,5 мм Na2PO4] ба қатра илова кунед. Маҳлул дар ҳарорати хонагӣ барои 5 дақиқа инкубатсия карда шуд ва сипас ба табақи 10 см бо ҳуҷайраҳои HEK293T аз 30 то 40% омехта илова карда шуд. Шаш соат пас аз интиқол, муҳит ба DMEM пеш аз гармшуда + 10% FBS иваз карда шуд. Таҷриба 14 соат пас аз интиқол гузаронида шуд.
Протеин бо истифода аз формати бевазнии EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (Thermo Fisher Scientific) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда биотинил карда шуд. Хулоса, сафеда тавре ки дар боло тавсиф шудааст, тоза карда шуд ва дар як шабонарӯз дар 1x PBS диализ карда шуд. Реагенти EZ-Link NHS-PEG4-Biotin ба сафеда дар таносуби молярии 1:20 илова карда шуд ва дар ҳарорати хонагӣ барои 30 дақиқа инкубатсия карда шуд. Реагенти биотини реаксиянашударо тавассути диализ дар 1x PBS дар як шабонарӯз хориҷ кунед. Сипас протеини нишондодашуда бо филтр стерилизатсия карда шуд, тақсим карда шуд ва дар -80 ° C нигоҳ дошта шуд.
Ҳуҷайраҳои интиқолшудаи HEK293T (1 × 105), iBMDM ё ҳуҷайраҳои экссудати перитонеалиро ба ҳар як чоҳи V-пластин илова кунед, бо PBS бишӯед ва сипас бо 50 мкл LukAB-и биотинилшуда дар PBS дар консентратсияи нишондодашуда дар ях 10 дақиқа инкубатсия кунед. . Пеш аз муолиҷаи LukAB, iBMDM ва блокатори Fc (1:100) барои 1 соат дар 37 ° C пешакӣ инкубатсия карда шуданд. Ҳуҷайраҳоро ду маротиба бо PBS бишӯед ва PerCP Cy5.5 стрептавидин (1:300) (BioLegend, 405214), APC CD11b (1:300) (BioLegend, 101212) ва Fixable Viability Dye eFluor 450 (1:1500) -ро истифода баред. (eBioscience, 65-0863-18) дар PBS дар ях барои 40 дақиқа ҷойгир карда шуд. Ҳуҷайраҳоро ду маротиба бо PBS бишӯед ва дар буфери фиксатсияи FACS дубора суспенд кунед [PBS + 2% FBS + 2% PFA + 0,05% (w/v) азиди натрий]. Барои ба даст овардани маълумотҳои цитометрии ҷараёни CytoFLEX (Beckman Coulter) ва барои таҳлили маълумот нармафзори FlowJo (TreeStar Inc.) истифода шуд.
Тамоми муши iBMDM, ки WT ё hCD11b-ро ифода мекунад, бо 4% формальдегид собит карда шуд, 3 маротиба бо PBS шуста шуд ва дар консентратсияи 106 ҳуҷайра/мл дубора суспензия карда шуд. Бо истифода аз усули шабеҳе, ки Мубайва ва дигарон тавсиф кардааст, бо истифода аз усули устоди C1 дар системаи идоракунии Biacore T200, ҳуҷайраҳоро дар чипи сенсори Series C1 C1 ислоҳ кунед. (37). Ҳуҷайраҳо бо суръати 5 мкл/дақ дар тӯли 900 сония ҷараён гирифтанд, то чипро ба ҳолати сершуда бор кунанд. Ячейкаи ҷараёни 1-ро дар ҷои холӣ ислоҳ кунед, то ду тарҳи истинодро иҷро кунед. LukAB тавассути ҳуҷайраҳои беимбилизатсияшуда бо суръати ҷараёни аз 8 нМ то 5 мкм ҷорӣ мешавад.
24 соату 48 соат пеш аз ҷамъоварии ҳосил, мушҳои аз 8 то 9-ҳафтаинаи WT ё hCD11b C57BL/6 ба дохили перитоналӣ бо штамми гармии ғайрифаъолшудаи Staphylococcus aureus Newman 1 × 108 CFU ворид карда шуданд. Мушҳо бо CO2 эвтаниз карда шуданд ва RPMI + 0,1% альбумин хунобаи инсон (HSA) + 10 мм HEPES ба холигоҳи перитоне сӯзандору масҳ карда шуд. Ҳуҷайраҳоро ҷамъ кунед ва бишӯед. Ҳуҷайраҳоро (150,000) бо консентратсияи муайяншудаи LukAB дар 5% (ҳ/в) СО2 дар 37°C барои 3 соат инкубатсия кунед. Ҳуҷайраҳо бо PBS шуста шуда, бо PE-Cy7 CD11b (BioLegend, 101215), FITC Ly6G (BD, 557396), APC F4/80 (BioLegend, 123116), PerCP Cy5.5 Ly6C (BioLegend, B28011) ранг карда шуданд. CD11c (BioLegend), 117329) ва бо Fc маҳкам карда шуд, ки 1:200 дар PBS барои 20 дақиқа дар болои ях омехта карда шудааст. Ҳуҷайраҳо ду маротиба шуста шуданд ва дар PBS + 5% FBS + йодиди пропидиум (PI) (2 мкг / мл) (G-Biosciences) дубора боз карда шуданд. Барои ба даст овардани маълумоти цитометрии ҷараён фавран цитометри ҷараёни CytoFLEX (Beckman Coulter) -ро истифода баред ва барои таҳлили маълумот нармафзори FlowJo (TreeStar Inc.) -ро истифода баред.
Тухмҳои бордоршудаи C57BL/6J аз мушҳои суперовуляцияшудаи C57BL/6J ҷамъоварӣ карда шуданд. Микроинъекция бо 45 мкл омехтаи тазриқии филтршуда, ки аз РНК-и роҳнамо (50 нг/мкл) [Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (IDT, пайдарпаии роҳнамо: CATGGGGCTGCTACCATCAG)] + Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA (IDT, Gene3A 137), Nuclease Cas9 (80 нг / мкл; Invitrogen) ва Шаблон ДНК (10 нг / мл) (Ҷадвали S6) дар буфери tris-EDTA. Шаблонҳои дастури RNA ва DNA дар Benchling.com тарҳрезӣ шудаанд. Сайти маҳдудкунии Xho I дар қолаби ДНК барои осон кардани генотипсозӣ таҳия шудааст.
Тухмҳои бордоршудаи сӯзандору ба ҳайвонҳои псевдоҳомила CD-1 (Лабораторияи Чарлз Ривер) имплантатсия карда шуданд ва 15 сагбачаҳои дар натиҷа пайдошуда барои муайян кардани аллеле, ки тағироти пешбинишударо дар экзони Итгам 9 муайян мекунанд, аз назар гузаронида шуданд. Намунаи ДНК-и геномиро васеъ кунед (Ҷадвали S6), маҳсули реаксияи занҷири полимеразиро (PCR) аз 379 ҷуфт асос (bp) тоза кунед ва онро бо Xho I. XhoI аз 7 аз 15 ҳайвон бурида, ва Xho I маҳсулоти PCR-ро буред. Ин ҳайвонотро пайдарпай кунед. Ду созанда бо тағиротҳои пешбинишуда барои чаҳор насл ба мушҳои C57BL/6J интиқол дода шуданд. Сипас ҳайвонҳои G4 бо тағиротҳои пешбинишуда убур карда мешаванд, то аз ду штаммҳои мустақил барои ғанисозии колония ва таҳқиқоти поёноб ҷуфтҳои зотпарварии гомозигота ҳосил карда шаванд.
Мушҳо дар дарун парвариш карда мешаванд ва дар шароити мушаххаси бидуни патоген нигоҳ дошта мешаванд ва дар синни 8 то 9 ҳафтаи синну сол ва ҷинс мувофиқанд. Истифодаи мушҳои hCD11b ва WT C57BL/6J барои таҷрибаҳо бародароне мебошанд, ки аз салибҳои hCD11b het×het тавлид шудаанд. Мушҳо ба таври тасодуфӣ аз рӯи генотип ва ҷинсашон омехта карда шуданд ва сипас ба гурӯҳҳо тақсим карда шуданд.
Мушҳои ҳашт то нӯҳҳафтаинаи WT ё hCD11b гомозиготи C57BL/6 тавассути мадор тақрибан бо 3×106, 1×107 ё 1×108 CFU Staphylococcus aureus сироят ёфтаанд. Таҷрибаҳои ибтидоӣ бо мушҳои гомозиготии hCD11b, ки аз салиби G4 het×het гирифта шудаанд, гузаронида шуданд. Ба сифати назорат партовҳои WT истифода мешуданд. Таҷрибаҳои минбаъда бо мушҳои гомозиготии hCD11b, ки аз салиби G4 homo×homo гирифта шудаанд, гузаронида шуданд. Штамми Staphylococcus aureus, ки дар ин тадқиқот истифода шудааст, аз штамми USA300 LAC гирифта шудааст ва дар ҷадвали S4 муфассал оварда шудааст. Як ё се рӯз пас аз сироят, мушҳо бо CO2 эвтаниз карда шуданд. Ҷигар ва гурдаҳо берун карда шуданд, дар PBS стерилизатсияшуда гомогенизатсия карда шуданд, ба таври пай дар пай маҳлул карда шуданд ва сипас дар TSA барои ҳисоб кардани CFU пӯшонида шуданд. Барои ҳар як штамм аз ду то се таҷрибаи мустақил гузаронида шуд.
Антиденои моноклоналии анти-ЛукА (2мкг/мл) дар чоҳҳои лавҳаи Immulon 2HB 96-чоҳ дар буфери карбонат-бикарбонат дар як шаб дар 4°С фаро гирифта шуд. Чоҳҳо бо буфери блотинг (2% шири хушки хушк, 0,9% NaCl, 0,05% Tween 20, PBS) баста шуданд, шуста шуданд ва бо ҳозима дар буфери 1x таҳлили радиоиммунопреципиатсия (Abcam) + 1х Ингибитори Halt Protease узвҳо инкубатсия карда шуданд. якҷоя дар ҳарорати хонагӣ бо коктейл (Thermo Scientific) дар шароити ларзиш барои 1 соат. Чоҳҳоро шуста, бо зардоби заргӯши зидди ЛукА (35) дар маҳлули 1:500 барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия мекунанд. Баъдан, чоҳҳо шуста шуда, бо HRP зидди харгӯш дар маҳлули 1:2500 барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуданд. Чоҳҳоро бишӯед ва бо субстрати 100 мкл TMB барои 5 дақиқа инкубатсия кунед. Реаксия бо кислотаи сулфати 100 мкл қатъ карда шуд ва ҷаббида дар 450 нм чен карда шуд. LukAB (микрограммаҳо/орган) бо роҳи муқоиса бо каҷи стандартӣ муайян карда мешавад, ки тавассути ченкунии LukAB дар узвҳое муайян карда мешавад, ки ба онҳо миқдори маълуми LukAB илова карда шудааст.
C57BL / 6 мушҳои синнашон аз 8 то 9 ҳафта бо ретро-орбиталӣ бо PBS ё тақрибан 1 × 107 CFU Staphylococcus aureus сӯзандору карда шуданд. Як рӯз пас аз сироят, мушҳо эвтаниз карда шуданд. Ҷигар ва гурда хориҷ карда шуданд, дар RPMI гомогенизатсия карда шуданд ва сипас дар 200 U коллагеназаи навъи VIII (Sigma-Aldrich, C2139) ва 0,2 мг DNase I (Sigma-Aldrich, DN25) ҳазм карда шуданд. Гомогенат филтр карда шуд, шуста ва ба градиенти 40/80% Percoll бор карда шуд. Градиентро центрифуга кунед, то қабати ҳуҷайраҳои сафеди хунро хориҷ кунед. RBC бо 1 × BD Pharm Lyse лизи карда шуд ва шуста шуд. V500 CD11b (BD, 562128), PE-Cy7 CD45 (BioLegend, 147704), PE Ly6G (BD, 551461), APC F4/80 (BioLegend, 123116) ва Fc-ро дар PBS дар консентратсияи 1:200 истифода баред. Доғро барои 20 дақиқа дар рӯи ях ҷойгир кунед, ду бор бишӯед ва дар буфери фикси FACS дубора суспенд кунед [PBS + 2% FBS + 2% PFA + 0,05% (w/v) азиди натрий]. Барои ба даст овардани маълумотҳои цитометрии ҷараёни CytoFLEX (Beckman Coulter) ва барои таҳлили маълумот нармафзори FlowJo (TreeStar Inc.) истифода шуд.
Тафсилоти оморӣ (рақамҳои n, санҷиши истифодашуда ва таърифи сатрҳои хатогӣ) дар рисола тасвир шудааст. Барои таҳлили маълумоти цитометрии ҷараёни FlowJo истифода баред. Аҳамияти оморӣ бо истифода аз Prism 7.0 b, таҳлили дуҷонибаи дисперсия (ANOVA) бо муқоисаи сершумор бо истифода аз санҷиши пост-хок Tukey, санҷиши хи-мураббаъ ё санҷиши ҷуфтнашудаи як думдор ё ду думдори Student t (тавре ки нишон дода шудааст) муайян карда шуд.
Барои маводи иловагӣ барои ин мақола, лутфан нигаред ба https://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/11/eaax7515/DC1
Ин мақолаи дастрасии кушодаест, ки тибқи шартҳои иҷозатномаи Creative Commons Attribution-Non-Commons паҳн карда мешавад, ки ба истифода, паҳнкунӣ ва такрористеҳсолкунӣ дар ҳама гуна васоити ахбори омма имкон медиҳад, ба шарте ки истифодаи ниҳоӣ ба манфиати тиҷоратӣ набошад ва асос ин аст, ки кори аслӣ дуруст аст. Истинод.
Эзоҳ: Мо танҳо аз шумо хоҳиш мекунем, ки суроғаи почтаи электрониро пешниҳод кунед, то шахсе, ки шумо ба саҳифа тавсия медиҳед, бидонад, ки шумо мехоҳед паёми электрониро бубинед ва почтаи электронӣ спам нест. Мо ягон суроғаи почтаи электрониро сабт намекунем.
Ин савол барои санҷидани он, ки оё шумо меҳмони инсонӣ ҳастед ва барои пешгирии ирсоли спамҳои худкор истифода мешавад.
Муаллиф: KM Boguslawski, AN McKeown, CJ Day, KA Lacey, K. Tam, N. Vozhilla, SY Kim, MP Jennings, SB Koralov, NC Elde, VJ Torres
Истифодаи модели нави муш барои бартараф кардани хосияти навъи токсинҳои MRSA LukAB метавонад нақши LukAB-ро дар vivo муқаррар кунад.
Муаллиф: KM Boguslawski, AN McKeown, CJ Day, KA Lacey, K. Tam, N. Vozhilla, SY Kim, MP Jennings, SB Koralov, NC Elde, VJ Torres
Истифодаи модели нави муш барои бартараф кардани хосияти навъи токсинҳои MRSA LukAB метавонад нақши LukAB-ро дар vivo муқаррар кунад.
© 2021 Ассотсиатсияи Амрико оид ба пешрафти илм. ҳамаи ҳуқуқ маҳфуз аст. AAAS шарики HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ва COUNTER мебошад. Advances Science ISSN 2375-2548.
Вақти фиристодан: 18 март-2021
