Испрашување на интерпоединецот на отворениот протонски канал Hv1 со алостерично поврзана сонда

Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го исклучите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да се осигурате континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript. Протонскиот канал Hv1 напонски затворен е димерен комплекс кој се состои од два домени за сензори на напон (VSDs), од кои секоја содржи затворена патека на протонска продор. отворената состојба во двата VSD е познато дека се јавува кооперативно; сепак, малку е познато за основните механизми. Меѓусубединичните интерфејси играат клучна улога во алостеричните процеси; сепак, таквите интерфејси не се идентификувани во отворените Hv1 канали. Овде демонстрираме дека дериватите на 2-гванидинотиазол блокираат два Hv1 VSD на кооперативен начин и користат едно од овие соединенија како сонда за алостерично спојување помеѓу отворените подединици. Откривме дека екстрацелуларниот крајот на првиот трансмембрански фрагмент на VSD формира интерфејс меѓу подединица што посредува во спојувањето помеѓу местата за врзување, додека доменот на намотан калем не е директно вклучен во овој процес. Исто така, најдовме силни докази дека протон-селективниот филтер на каналот ја контролира соработката за врзување на блокаторите . Напонските протонски канали играат важна улога во различни организми, од фитопланктон до луѓето1. Во повеќето клетки, овие канали го посредуваат протонскиот одлив од протонската мембрана и ја регулираат активноста на NADPH оксидазата. Единствениот познат напонски протонски канал кај луѓето е Hv1, кој е производ на генот HVCN12,3. Hv1 (познато како VSOP) се покажа дека игра улога во пролиферацијата на Б-клетките4, производството на реактивни видови кислород од страна на вродениот имунолошки систем5,6,7,8, сперматозоидите подвижност9 и рН регулација на површинската течност на дишните патишта10. Овој канал е вклучен во неколку прекумерно изразени типови на рак, како што се малигнитет на Б-клетките4,11 и карциноми на дојка и колоректален карцином12,13. Утврдено е дека прекумерната активност на Hv1 го зголемува метастатичкиот потенцијал на канцерогените клетки 11, 12. Во мозокот, Hv1 е изразен од микроглија, а неговата активност се покажа дека го влошува оштетувањето на мозокот кај моделите на исхемичен мозочен удар. Протеинот Hv1 содржи домен со чувствителност на напон (VSD), кој се состои од четири трансмембрански сегменти наречени S1 до S414. Ciona gutis15. Во овие други протеини, C-крајот на S4 е прикачен на ефекторниот модул, доменот на порите или ензимот. Во Hv1, S4 е поврзан со доменот со свиткана намотка (CCD) кој се наоѓа на цитоплазматската страна на мембраната . значајна улога во процесот на влез. добро разбрана.Кристалната структура на химеричкиот протеин Hv1-CiVSP не дава информации за овој интерфејс, бидејќи тримерната организација на комплексот на кристализираните канали може да резултира од замената на природниот Hv1 CCD со патентот од квасец леуцин GCN424. Една неодамнешна студија за организацијата на подединицата на каналот Hv1 заклучи дека две спирали S4 преминуваат во CCD без сериозно нарушување на секундарната структура, што резултира со долги спирали кои започнуваат од мембраната и се проектираат во цитоплазмата. оваа студија предлага Hv1 VSDs да контактираат едни со други по должината на S4 сегментот. Сепак, други студии предложија алтернативни интерфејси помеѓу VSDs. Овие интерфејси ги вклучуваат S1 сегментите 17, 21, 26 и надворешните краеви на S2 сегментот 21. Можна причина за конфликтот Резултатите од овие студии се дека алостеричното спојување помеѓу VSD е испитувано во однос на процесот на затворање, кој зависи од затворените и отворените состојби, а интерфејсот помеѓу VSD може да варира во различни промени на состојбите во конформацијата. Овде, откривме дека 2-гванидинотиазол ги инхибира Hv1 каналите со синергетско врзување за две отворени VSD и користевме едно од соединенијата, 2-гванидинобензотиазол (GBTA), за да ја испитаме интеракцијата помеѓу подединиците во отворена состојба. интерфејс. Откривме дека кривата на врзување GBTA може добро да се опише со квантитативен модел во кој врзувањето на инхибитор за една подединица резултира со зголемување на сврзувачкиот афинитет на соседната подединица. Исто така, откривме дека остатоците D112, филтри за селективност за каналот 27, 28 и дел од местото за врзување на дериватот на гванидин 29 ја контролираат GBTA врзувачката соработка. Покажуваме дека кооперативното врзување се одржува во Hv1 димерот, каде што CCD се одвојува од сегментот S4, што сугерира дека интерфејсот меѓу подединицата во CCD не е директно посредува алостерично спојување помеѓу местата за врзување GBTA. Спротивно на тоа, откриваме дека фрагментот S1 е дел од интерфејсот помеѓу подединиците и предлага распоред на соседните VSD со екстрацелуларниот крај на S4 спиралата подалеку од центарот на димерот за да се овозможи фрагментот S1 да биде во отворена состојба. Инхибиторите на мали молекули на Hv1 се корисни како антиканцерогени лекови и невропротективни агенси. Меѓутоа, до денес, неколку соединенија биле способни да го инхибираат каналот30,31,32,33. Меѓу нив, 2-гуанидинобензимидазол (2GBI, соединение [1] на сл. 1а) и неговите деривати го блокираат VSD29,32 продорот на протоните низ каналот. Се смета дека врзувањето на таквите соединенија се јавува независно во двете отворени подединици. претходно беше покажано дека го инхибира Hv1 речиси исто толку ефикасно како 2GBI кога се тестираше во концентрација од 200 μM (Слика 1б). Ги испитавме другите деривати на тиазол и откривме дека некои од нив го инхибираат каналот со слична или поголема моќ од GBTA (сл. 1 и дополнителни текст). Ги определивме кривите на одговор на концентрацијата на четири деривати на тиазол (GBTA и соединенија [3], [6] и [11], Сл. 1в) и откривме дека тие се поостри од оние на 2GBI. Коефициентите на Хил (h) дериватите на тиазол се движеа од 1,109 ± 0,040 до 1,306 ± 0,033 (Сл. 1c и дополнителна слика 1). Спротивно на тоа, коефициентот Hill за 2GBI беше 0,975 ± 0,024 29, Сл. 2а и дополнителна слика 1). место за врзување, 29,32 резониравме дека врзувањето на дериват на тиазол за една субединица може да го подобри врзувањето на втора инхибиторна молекула за соседната субединица. GBTA беше тест соединението со највисок коефициент Хил. Затоа, го избравме ова соединение за понатамошно проучување на механизмот на врзувачка синергија и се користи 2GBI како референтна негативна контрола. (а) Тест соединенија: [1] Референтен Hv1 инхибитор 2-гуанидино-бензимидазол (2GBI).[2] 2-гванидино-бензотиазол (GBTA), [3] (5-трифлуорометил-1,3-бензотиазол-2-ил)гванидин, [4] нафто[1,2-d][1, 3] Тиазол-2-ил -гванидин, [5](4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гванидин, [6](5-бромо-4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гванидин, [7] фамотидин, [8] етил естер на 2-гванидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбоксилна киселина, [9] 2-гванидино-4-метил етил-1,3-тиазол-5-карбоксилат, [10 ](2-гванидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил)етил ацетат, [11]1-[4-(4-Хлорофенил)-1,3-тиазол-2-ил]гванидин, [ 12]1-[4-(3,4-диметоксифенил)-1,3-тиазол-2-ил]гванидин. (б) Инхибиција на активноста на човечкиот Hv1 од наведените гванидинотиазоли и референтното соединение 2GBI (сино-зелени шипки) .Hv1 протонските струи беа измерени во плаките од внатре-надвор на ооцитите на Xenopus како одговор на деполаризација од потенцијал за задржување од -80 mV до +120 mV. Секој инхибитор беше додаден во бањата со концентрација од 200 μM. pHi = pHo = 6,0 .Податоците се средна ± SEM (n≥4). (в) Зависна од концентрацијата инхибиција на човечки Hv1 со соединенија [2], [3], [6] и [11]. Секоја точка ја претставува средната инхибиција ± SD од 3 до 15 мерења. Линијата е приспособување на ридот што се користи за да се добијат привидните вредности на Kd пријавени во дополнителната табела 1. Коефициентите на рид беа одредени од одговарањата пријавени во дополнителната слика 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h (2) = 1,306 ± 0,033, h (3) = 1,25 ± 0,07, h (6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (види Методи). (а, б) Соединенијата 2GBI и GBTA го инхибираат димерниот и мономерниот Hv1 на начин зависен од концентрацијата. Секоја точка ја претставува средната инхибиција ± SD од 3 до 8 мерења и кривата е Хил одговара. Коефициентите на Хил (h) прикажани во вметнати хистограми беа одредени од одговарањата пријавени во дополнителните слики 3 и 4. Одговорот на концентрацијата на GBTA прикажан во (а) е ист како оној на сл. 1в. Видете дополнителна табела 1 за привидните вредности на Kd. (в) Моделирање на заедничкото врзување на GBTA со димерикот Hv1. Цврстата црна линија го претставува усогласувањето со експерименталните податоци со равенката (6), која го опишува моделот на врзување прикажан во (г). Испрекинати линии означени Sub 1 и Sub 2 ја претставуваат бимолекуларната асоцијација -дисоцијациски рамнотежни криви на првиот и вториот сврзувачки настани, соодветно (Под 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Под 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(г) Шематски дијаграм на предложениот механизам на блокот Hv1. Во случај на GBTA, врзувањето за една отворена подединица го зголемува афинитетот на соседната отворена подединица (Kd2 0,05) намалување на коефициентот на Хил на врзување на GBTA за GGG каналите во споредба со дивиот тип (сл. 5в), што сугерира дека и покрај неговата улога во одржувањето на две подединици заедно се важни, но CCD не посредува директно меѓупоединично алостерично спојување помеѓу местата за врзување GBTA. (а) Шематски дијаграм на Hv1 димерот со мутација на триглицин на внатрешниот крај на S4 дизајниран да го наруши спојувањето меѓу подединицата посредувано од доменот на цитоплазматски намотан калем (сини стрелки). (б) Шематски приказ на Hv1 димери и димери на лигатура со индицираните мутации, дизајнирани да ги тестираат фрагментите S1 вклучени во спојувањето помеѓу подединици (сини стрелки). ± SD од 3 до 10 мерења. Кривата беше приспособување на ридот што се користеше за да се добијат привидни вредности на Kd (види дополнителна табела 1). Hv1 WT се прикажани како испрекинати линии. Ѕвездичките укажуваат на статистички значајни разлики помеѓу мутантните и WT премините (p 0.05, Сл. 5d,i). ). Од друга страна, мутацијата D123A значително го намали Хил коефициентот на GBTA (p 0,05/14). Со оглед на тоа што неутрализирањето на полнењето на позицијата 123 на двете подединици резултираше со силна промена во GBTA врзувачката соработка, додека менувањето на полнењето на двете подединици имаше само мал ефект, ја проширивме анализата за да вклучи само една подединица со каналот за инверзија на полнење. генерира Hv1-поврзани димери со замена D123R во C-терминалната субединица (сл. 5б) и ја измери инхибицијата на концентрацискиот одговор со GBTA и 2GBI. Откривме дека коефициентот Хил на врзување GBTA за WT-D123R каналите е значително повисок од тој од див тип Hv1 (p 0,05). Исто така, откривме дека во отсуство на βME, коефициентот Хил на врзување GBTA за димерот D112E I127C Hv1 беше значително повисок од оној измерен во присуство на редуцирачки агенси (сл. 6е и дополнителна слика 4), што значи дека мутацијата D112E не го укина зголемувањето на соработката за врзување GBTA што произлегува од вкрстено поврзување на цистеин 127. Коефициентот Хил на 2GBI врзување за димерите D112E, I127C Hv1, исто така, не беше значително засегнат од мутацијата D112E (Слика 1).6d и Дополнителен Сл. 3). Земени заедно, овие наоди сугерираат дека врзувањето GBTA е засилено со интеракцијата помеѓу надворешните краеви на фрагментите S1 во соседните Hv1 подединици преку атрактивни електростатски интеракции или преку формирање на ковалентни врски помеѓу супституираните цистеини Алостеричното спојување помеѓу местата се зголемува и резултира со врзувачка соработка. Додека ефектот на привлечните електростатски интеракции врз соработката може да се укине со мутацијата D112E, ефектот на ковалентни врски не може. Во нашето истражување на хемискиот простор достапен за врзување деривати на гванидин за Hv1 каналите, откривме дека 2-гванидинотиазолите како GBTA имаат поголема зависност од концентрацијата од 2-гуанидинобензимидазолите (сл. 1в). и мономерните канали (сл. 2а, б) и димерниот канал во кој една подединица била претходно врзана за инхибиторот (сл. 4) нè наведоа да заклучиме дека инхибицијата на Hv1 со GBTA Дејството е синергистички процес, и местата за врзување на соединенијата во двете подединици се алостерски споени. Откритието дека GBTA се врзува за отворениот канал, како што беше претходно прикажано за поврзаното соединение 2GBI32, сугерира дека алостеричното спојување може да биде конкретно проценето во отворена состојба. Нашиот кооперативен модел на врзување беше во можност квантитативно да ја опише инхибицијата на HV1 со GBTA (Сл. 2С) и да ги објасни различните ефекти на 2GBI и GBTA врз распаѓањето на струите на опашката на каналот по реполаризацијата на мембраната, што го поддржува нашето толкување на процесот на врзување. Максималниот коефициент на рид што може да се постигне во алостеричен протеин со две места за врзување (како што е HV1) е. Синергистичка слободна енергија, разликата помеѓу врзувачките слободни енергии на најниските и највисоките места за афинитет (види методи), беше 1,3 kcal/крт во случај на HV1 див тип и 2,7 kcal/крт во случај на HV1 i127c. од кислород до хемоглобин е најпознатиот и добро проучен пример за процесот на соработка38. За човечки хемоглобин (тетрамер со четири алостерички споени места за врзување), коефициентот на ридот се движи од 2,5-3,0, со вредности кои се движат од 1,26 до 3,64 KCAL/MOL, во зависност од експерименталните услови38.Тој, во однос на глобалната енергетика, соработката на врзувањето на GBTA за HV1 не е значително различна од онаа на врзувањето на О2 за хемоглобин кога се разгледува различниот број на протеински под -единици во двата система. Во нашиот модел на синергија, врзувањето на молекулите на GBTA на една субјект резултира во зголемување на врзувачкиот афинитет на соседната субјект. Ние предвидуваме процес во кој преуредувањето на обврзувачката околина што резултира од првиот настан за врзување (индуцирано вклопување) води кон Промени во интеракциите помеѓу субјектите. Во одговор на овие промени, соседните субјекти ги менуваат своите места за врзување, што резултира во построго врзување на GBTA.Дајќи го овој процес, S1 Aspartate D112 е одговорен за преуредување на местото за врзување поврзано со зголемен врзувачки афинитет.D112 претходно се покажа дека е дел од патеката за протонска протон HV1 и да дејствува како филтер за селективност27,28. Нашите резултати покажуваат дека филтрите за селективност во двете под -единици HV1 се алостерички споени во отворена состојба. Фигурата 7А ја покажува приближната локација на местото за врзување на GBTA и локацијата на остатоци D112, D123, K125 и I127 на шематски од шемата на HV1 VSD базирана на кристалната структура на химерата HV1-CIVSP.Подредени насоки за алостерично спојување што вклучуваат екстрацелуларен крај на S1 се прикажани со црни стрели. (А) Шематски на HV1 VSD. базирана на кристалната структура на химерата HV1-CIVSP, спиралните сегменти се прикажани како цилиндрични. Во оваа конфигурација, внатрешниот крај на S4 сегментот се спојува со CCD (не е прикажано). Предвидените локации на врзаната GBTA се прикажани како сиви овали. Блак стрелките означуваат патеки вклучени во алостеричното спојување помеѓу местата за врзување во две соседни субјекти. Во две различни конфигурации на димер, како што се гледа од екстрацелуларната страна на мембраната. Одвојување на надворешните краеви на двата S4 хелики (испрекинати стрели), го произведува аранжманот прикажан десно. Во оваа конфигурација, остатоци D123 и I127 од соседните субјекти им е дозволено да се приближат. (В) Шематско претставување на CIVSP VSD Во конфигурацијата на затемнувањето што се наоѓа во кристалната структура 4G80.Позицијата P140 во CIVSP одговара на позицијата D123 во HV1. Нашите резултати покажуваат дека одбивната електростатска интеракција помеѓу остатокот 123 (123D/123d или 123R/123R) е поврзана со „нормално“ ниво на соработка за врзување на GBTA во отворена состојба и ја менува интеракцијата од одбивност во привлекување (123D/123R) , зголемена соработка (Сл. 5G). Се очекува дека отстранувањето на одбивната интеракција со замената на аланин, исто така, ќе доведе до зголемена соработка. Како и да е, забележано е намалување на кооперативноста на димерот 123A/123A димер (Сл. 5Е). Објаснувањето е дека дестабилизирачкиот ефект на поставување на хидрофобни остатоци во хидрофилно опкружување може да го надмине стабилизирачкиот ефект како резултат на елиминацијата на одбивните интеракции помеѓу остатоците од Д123, што резултира во целокупно намалување на обврзувачката кооперативност.Мони и сор.39 неодамна објавија дека растворувачката достапност во Позицијата D171 на Ciona Gutis CI-HV1 (што одговара на D123 кај човекот HV1) е зголемена при активирање, поддржувајќи ја идејата дека D123 се наоѓа во хидрофилна околина во отворена состојба. Гејтингот на каналите HV1 е познато дека се случува преку повеќе транзиции19,20,26,39,40,41.Киу и др. , проследено со посебна транзиција што предизвикува протоните да се отвори спроводливост и во двата единици. Пертурбацијата на флуоресцентниот сигнал е во согласност со присуството на електростатски интеракции помеѓу остатоците од Д171 на соседните субјекти во одреден момент по должината на координатите на реакцијата на конформациската промена. Ова толкување е во согласност со нашето откритие дека остатокот од Д123 електростатички комуницира во отворена состојба и посредува во алостеричното спојување помеѓу местата за врзување на ГБТА. Фуџивара и сор25 предложија димерниот интерфејс на цитоплазматскиот домен на калем-калем да се протега во мембраната за да содржи две S4 хелики (Сл. 7Б, лев панел). Целата VSD и функционална анализа на регионот што ги поврзува S4 Helix и CCD.in отсуството на градиент на трансмембранска pH вредност, каналите HV1 бараат значителна деполаризација на мембраната за отворање, а вкрстеното поврзување на цистеин се јавува под услови кога каналот е преовладувачки затворен. Затоа, откриениот интерфејс S4-S4 најверојатно ја одразува конфигурацијата надвор од државната субјект. Другите студии пронајдоа докази за вклучување на S1 и S2 во интеракции меѓусебни за време на Gating17,21,26, кои сугерираат дека каналите можат да усвојат различни конфигурации на под-единици во отворено и Затворени држави, идеја во согласност со наодите на Мони и сор. S1 се движи 39 за време на порти. Еве, ние покажуваме дека, во отворена состојба, екстрацелуларните краеви на S1 Helix се доволно блиску за да ги поддржат директните електростатски интеракции кои посредуваат во алостеричното спојување помеѓу субјектите. Во конфигурацијата на димерот со проширени интеракции S4-S4, хеликовите S1 се премногу далеку Освен едни од други за да комуницирате директно. Како и да е, ротација на стрелките на часовникот од 20 ° на двете под-единици VSD околу оската нормална на мембраната, во комбинација со раздвојување на надворешните краеви на двата S4 хелики, даде конзистентна конфигурација S1-S1 конзистентна со нашите наоди (Сл. 7б, десен панел). Ние ја препорачуваме оваа конфигурација за каналот во отворена состојба. Иако се смета дека ензимот CIVSP функционира како мономер, кристалната структура на неговата изолирана VSD е заробена во димерска состојба. Надворешните краеви на S1 Helices во овој димер се просторно близу заедно, а целокупната конфигурација е слична на онаа предложена За HV1 (Сл. 7С). Во димензијата на CivSP, најблискиот остаток од соседната субјект беше пролин на позиција 140 (Сл. 7С). Винкретно, p140 во CIVSP одговара на позицијата D123 во HV1. и Civsp Dimers сугерира дека VSD на овие протеини имаат внатрешна тенденција да формираат интерфејс каде екстрацелуларните краеви на S1 комуницираат. Суштинската улога на HV1 во активирањето на клетките на спермата го прави овој канал атрактивна цел за лекови за контрола на плодноста на мажите. Покрај тоа, се покажа дека активирањето на HV1 во микроглија го влошува закрепнувањето од исхемичен мозочен удар. Заклучена активност на HV1 се покажа дека е поврзана со пониска со пониска Опстанок кај пациенти со дојка 12 или колоректален карцином 13 и се смета дека придонесува за малигнитети на Б-клетки 11. Затоа, малите молекулни лекови насочени кон HV1 можат да се користат како невропротективни агенси или антиканцерогери терапевтици. Откривањето дека деривативите на гванидинотиазол можат да предизвикаат конформациски редукции во Отворената единица HV1, што доведува до зголемен афинитет за врзување, може да доведе до развој на посилни лекови насочени кон каналите HV1. Мутагенезата насочена кон човекот HV1 беше извршена со употреба на стандардни PCR техники. Во конструкцијата HV1NCCIVSP, остатоците 1-96 и 228-273 на HV1 беа заменети со остатоци 1-113 и 240-576 од CIVSP18.in HV1-поврзаниот димери, поврзан со димензии, поврзан со HV1, поврзан со димери, поврзан со HV1, поврзан со диментот, поврзан со HV1, поврзан со диментот, поврзан со HV1, поврзан со диментот, поврзан со HV1, поврзан со димензии, поврзан со HV1, поврзан со диментот, поврзан со HV1, поврзан со диментот, поврзан со HV1, поврзан со диментот, поврзан со HV1, поврзан со диментот, поврзан со HV1, поврзан со диментот, поврзан со HV1, поврзан со диментот, поврзан со HV1, поврзан со HV1. Ц-терминалот на една под-единица е поврзан со N-терминалот на втората под-единица преку GGSGGSGGSGSGGSGG Linker. Плазмидите PGEMHE кои ги содржат различните конструкции беа линеализирани со NHE1 или SPH1 RUNTRICTION ENZIME Комплет за транскрипција на T7 mmessage mmachine (Ambion) .1-3 дена пред електрофизиолошките мерења, crNA беше инјектирана во ксенопски ооцити (50 nl по клетка, 0,3-1,5 μg/μl) .Сета V и VI ооцити од Xenopus laevis (Nasco) беа добиени Од биоцит био -наука. Следење на инјектирање на РНК, клетките се одржуваа во ND96 медиум што содржи 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM пирават, 100 μg/ml гентамицин, pH 7,2 18 ° C. . 2-гуанидино-бензимидазол [1], 2-гуанидино-бензотиазол [2], (4-метил-1,3-тиазол-2-ил) гванидин [5], (5-бромо-4-метил-1,3 -thiazol-2-ил) гванидин) [6], етил 2-гуанидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбоксилат [8], етил 2-гуанидино-4- метил-1,3-тиазол- 5-карбоксилат [9] и (2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил) етил ацетат [10] биле од Сигма-Алдрих.Фамотидин [7] бил од пратеник биомедицински јазик.1- [4 4 -(4-хлорофенил) -1,3-тиазол-2-ил] гванидин [11] и 1- [4- (3,4-диметоксифенил) -1,3- тиазол-2-ил] гванидин [12] бил Од Матрикс научни. Овие соединенија се со највисока чистота комерцијално достапна. Тие беа растворени во суво DMSO за да се генерираат раствор од 100 мм акции, кој потоа беше разреден во растворот за снимање на посакуваната конечна концентрација. Најмалку 99% чистота. До суспензија на 2-амино-4- (трифлуорометил) бензентиол хидрохлорид (1,02 g, 4,5 mmol) во 25 ml воден хидрохлорна киселина (2,5 N) се додава цврста дикиандиамиад (380 mg, 4,5 mmol), а резултатот од хетерогена мешавина беше рефлуксирана со енергично мешање 4 часа. Реакцијата мешавина се лади на собна температура и се неутрализира со постепено додавање на 10N калиум хидроксид. Формираниот бел талог е филтрирана, измиена со ладна вода (3 × 50 ml), исушена во рерна ( 65 ° C) за неколку часа, а потоа рекристализиран од етил ацетат/нафтен етер за да се даде бел цврст (500 мг, 48 %); MP 221–222 ° C (светлина 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): δ [ppm] = 7,25 (многу широк S, 4 H), 7,40 (D, 1 H, J = 8,1 Hz), 7,73 (S, 1 H), 7.92 (D. ? = 272 Hz), 126.1 (Q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152.1, 158.4, 175.5.HRM (ESI): M/Z пресметана вредност.for C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, пронајден : 261.0419. Нафто [1,2-Д] тиазол-2-амин (300 мг, 1,5 ммол), синтетизиран како што е опишано претходно, се загреваше на 200 ° С во маслена бања во мала тест цевка.300 мг (голем вишок) цијанамид и 1,0 ml conc. На топлото соединение беше додадено како хлороводородна киселина брзо и смесата се чуваше во маслото за бања околу 2 минути, за кое време се испари најголемиот дел од водата. Смесата за реакција потоа се лади на собна температура и како резултат на зацврстен материјал беше скршен на мали парчиња и се миеше со вода за да се обезбеди бледо жолт аморфен цврст. (38 мг, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [PPM] = 7,59 (T, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,66 (T, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,77 (D, 1 H , J = 8,6 Hz), 7,89 (D, 1 H, J = 8,6 Hz), 8.02 (D, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (D, 1 H, J = 8,3 Hz) .13c NMR (150 MHz, DMSO-D6): δ = 119,9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.HRMS (ESI): M/z Пресметана вредност.for C12H11N4S (M + H) +: 243.06999999999 г. , пронајден: 243.0704. Протонските струи беа измерени во внатрешни и надворешни закрпи на ооцити кои изразуваат различни конструкции со помош на засилувач AxoPatch 200b контролиран од аксонски Digidata 1440A (молекуларни уреди) со софтвер PCLAMP10.интрацелуларни и екстрацелуларни решенија го имаат истиот состав: 100 mM 2- (N-моорфолино ) етанесулфонична киселина (МЕС), 30 мм тетраетиламониум (чај) мезилат, 5 мм чај хлорид, 5 мм етилен гликол-бис (2-аминоетил) -n, n, n ', n'-tetraacetic киселина (EGTA), прилагодени на PH 6.0 со чај хидроксид. Сите мерења беа извршени на 22 ± 2 ° C. Пипетата има отпорност на пристап од 1,5–4 MΩ. Трагите на струјата се филтрираат на 1 kHz, земени примероци на 5 kHz и анализирани со ClampFit10.2 (молекуларни уреди ) и потекло8.1 (OriginLab). Решенија што содржат различни концентрации на HV1 инхибитор и во некои случаи 10 mM βME беа воведени во бањата со гравитација преку колектор поврзан со систем за вентил VC-6 (Warner Instr.), Кој беше поминато преку софтверот PCLAMP TTL (транзистор- Transistor Logic) signals.Rapid perfusion experiments were performed using a multi-tube perfusion pencil (AutoMate Sci.) with a 360 μm diameter delivery tip mounted in front of a patch pipette.Channel inhibition was determined by isochronal amperometric measurements at the end of the +120 mV деполаризирачки пулс.GV мерењата беа извршени како што претходно опишани 18,20. се користи за да се поправи струјата на распаѓање 18. Со равенката на ридот: каде [i] е концентрацијата на инхибиторот I и H е ридскиот коефициент.